[发明专利]一种食用菌单倍体的无菌快速分离方法

说明书

本发明公开了一种食用菌单倍体的无菌快速分离方法，包括以下具体步骤：第一步，将菌丝置于液体培养基中培养得到成熟的菌丝体；第二步，制备染色菌丝液或染色原生质体悬浮液；第三步，确定二倍体和单倍体的分选参数，第四步，分选得到菌丝单倍体或原生质体单倍体。本发明优点在于克服了传统单倍体分选得率低、培育周期长的技术问题，本发明的整个培育过程可实现无菌分离，避免单倍体感染，同时培育周期短，分选得到的单倍体得率高，可直接作为杂交育种的原料，特别适用于平菇、香菇、木耳等二倍体食用菌的单倍体分离，为食用菌新品种的培育打下基础。

技术领域

本发明涉及食用菌育种技术，尤其是涉及一种食用菌单倍体的无菌快速分离方法。

背景技术

食用菌味道鲜美、营养丰富、具有很高的食用价值，有“素中之荤”的美誉。随着民众生活水平的提高，民众对食用菌的消费需求日益增加，对食用菌种类的要求也越来越多样化，仅河南的食用菌栽培种类多达30多种。因而，目前急需研发选育新的食用菌品种以填补市场空白、满足市场发展需求、满足民众消费需求。

食用菌育种技术主要有杂交育种、诱变育种、转基因育种等，杂交育种食用菌生产中最为快速有效、应用最多的育种方法，而在杂交育种中，获得大量单倍体是杂交育种的基础，现有食用菌单倍体的获取方式主要有单孢分离和原生质体分选，单孢分离包括孢子收集、多次梯度稀释、涂布、培养、挑选，鉴定等步骤后培育得到带细胞壁的单核菌丝（即菌丝单倍体），整个培育周期需要25天左右，耗时长且分选率低；原生质体分选包括菌丝体培养、制备原生质体、转接培养、人工挑取菌落后再生培养、镜检，最后得到不带细胞壁的单核原生质体（即原生质体单倍体），整个培育过程中人工挑取工作量大，挑取成功率小，使得再生培养后的单倍体得率仅为30%～60%，远远无法满足食用菌新品种的培育需求。

发明内容

本发明目的在于提供一种食用菌单倍体的无菌快速分离方法，分离周期短，且单倍体收率高达90%以上，可以直接作为杂交育种材料。

为实现上述目的，本发明采取下述技术方案：

本发明所述的食用菌单倍体的无菌快速分离方法，包括以下具体步骤：

第一步，将菌丝置于液体培养基中于25℃培养3～8天，无菌过滤得成熟的菌丝体；

第二步，取第一步得到的菌丝体于无菌离心管内，加入研磨珠研磨30～120s；将研磨后的菌丝体进行处理得到染色菌丝液或染色原生质体悬浮液；

第三步，将第二步得到的染色菌丝液或染色原生质体悬浮液用流式细胞仪进行倍性分析，找到有效的峰值区域，确定菌丝单倍体或原生质体单倍体的区域间阈值的M值，菌丝二倍体或原生质体二倍体的区域间阈值的M值，以及菌丝单倍体M值和菌丝二倍体M值的倍数关系或原生质体单倍体M值与原生质体二倍体M值的倍数关系；

第四步，按照第三步中确定的菌丝单倍体M值和菌丝二倍体M值调整流式细胞仪的分选参数，利用流式细胞仪对第二步中的染色菌丝液进行分选，收集得到菌丝单倍体；

或者按照第三步中确定的原生质体单倍体M值和原生质体二倍体M值调整流式细胞仪的分选参数，利用流式细胞仪对第二步中的染色原生质体悬浮液进行分选，收集得到原生质体单倍体。

所述第二步中将菌丝体处理成染色菌丝液的具体方法为：三角瓶内加入裂解液，将研磨后的菌丝转移至三角瓶内裂解20～40min，过滤，滤液内加入DAPI染色剂染色10～20min，得到染色菌丝液。

所述第二步中将菌丝体处理成染色原生质体悬浮液的具体方法为：三角瓶内加入酶解液，将研磨后的菌丝体转移至三角瓶内，酶解3～5h，过滤，依次用KCl溶液、STC溶液洗涤，再用STC溶液悬浮得到原生质体悬浮液，向原生质体悬浮液中加入DAPI染色剂染色10～20min得染色原生质体悬浮液。

所述第二步菌丝体酶解时菌丝体的重量与酶解液的体积比为1:5～1:10。