[发明专利]一种人外周血淋巴细胞的检测方法

说明书

本发明公开了一种人外周血淋巴细胞的检测方法。本发明取人抗凝外周血，分别加入抗人CD3、CD4、CD8、CD45单克隆抗体，以及抗人CD3、CD56、CD16、CD45单克隆抗体，然后再加入包含荧光探针的溶血素工作液，从而分别获得人外周血T淋巴细胞亚群和NK淋巴细胞亚群百分比和绝对计数值，实现对人外周血淋巴细胞的检测。本发明具有操作简便，样本稳定保存时间长，精确度高，多指标输出等优点。

技术领域

本发明属于细胞检测技术领域，特别是涉及一种人外周血淋巴细胞的检测方法。

背景技术

流式细胞术(Flow Cytometry,FCM)是七十年代发展起来的高科学技术，它集计算机技术、激光技术、流体力学、细胞化学、细胞免疫学于一体，同时具有分析和分选细胞功能。检测原理是荧光标记待测试细胞并制成单细胞悬液，根据接收激光照射后液流内细胞的散色光信号和荧光信号分析细胞的物理化学特征，如细胞大小、被测细胞内部颗粒的信息等。它不仅可测量细胞大小、内部颗粒的性状，还可检测细胞表面和细胞浆抗原、细胞内DNA、RNA含量等，可对群体细胞在单细胞水平上进行分析，在短时间内检测分析大量细胞，并收集、储存和处理数据,进行多参数定量分析；能够分类分选某一亚群细胞，分选纯度＞95％。在血液学、免疫学、肿瘤学、药物学、分子生物学等学科广泛应用。

T淋巴细胞和NK细胞是淋巴细胞的两种类群，能够体现基体细胞的免疫功能。

中国专利CN107063982A公开了一种流式细胞术检测鸡外周血淋巴细胞亚群的方法。但是上述专利公开的方法仅能输出各亚群的阳性百分比，结果较为单一，而单纯的阳性百分比仅为相对计数，如淋巴细胞整体细胞数都减少了，即绝对个数减少了，但相对的各群百分比可能维持不变。此外，上述专利的检测方法对淋巴细胞的提取操作时间较长，不利于淋巴细胞的绝对计数，同时会导致样本细胞的损伤和凋亡过程长，检测灵敏度偏低，影响检测结果。

发明内容

基于现有技术存在的缺陷，本发明的目的在于提供一种人外周血淋巴细胞的检测方法。本发明具有操作简便，样本稳定保存时间长，精确度高，多指标输出等优点。

为了达到上述的目的，本发明采取以下技术方案：

一种人外周血淋巴细胞的检测方法，包括以下步骤：

(1)T淋巴细胞亚群检测：

取人抗凝外周血加入流式管底部，加入抗人CD3、CD4、CD8、CD45单克隆抗体，涡旋混匀，室温下避光孵育；然后进一步加入包含荧光探针的溶血素工作液，涡旋混匀，室温下避光孵育；最后使用流式细胞仪进行检测，获得人外周血T淋巴细胞亚群百分比和绝对计数值；

(2)NK淋巴亚群检测：

取人抗凝外周血加入流式管底部，加入抗人CD3、CD56、CD16、CD45单克隆抗体，涡旋混匀，室温下避光孵育；然后进一步加入包含荧光探针的溶血素工作液，涡旋混匀，室温下避光孵育；最后使用流式细胞仪进行检测，获得人外周血NK淋巴细胞亚群百分比和绝对计数值。

本发明使用细胞膜表面抗原特异性抗体的单克隆抗体试剂直接标记人外周血，其中：白细胞共抗原分子CD45，用于区分不同的淋巴细胞群；抗体CD3、CD4、CD8特异性标记T淋巴细胞及其亚群分子；抗体CD16和CD56特异性标记NK淋巴细胞及其亚群分子。

进一步地，在上述方法中，所述步骤(1)的荧光探针为线粒体荧光探针；优选的，所述荧光探针为线粒体绿色荧光探针。

进一步地，在上述方法中，所述步骤(2)的荧光探针为溶酶体荧光探针；优选的，所述荧光探针为溶酶体绿色荧光探针。

本发明步骤(1)和步骤(2)分别采用线粒体荧光探针和溶酶体荧光探针结合淋巴细胞，完成细胞器标定。其中，线粒体荧光探针主要依据线粒体膜电位变化进行结合，溶酶体荧光探针主要依据溶酶体pH值变化进行结合。