[发明专利]柯萨奇病毒A10型假病毒的包装及血清中和抗体检测方法

说明书

本发明公开柯萨奇病毒A10型假病毒的表达及血清中和抗体检测方法，包括一种用于包装CA10型假病毒的重组表达质粒，重组表达质粒命名为CA10‑EGFP‑CAPSID质粒，重组表达质粒具有序列表中SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列；一种表达CA10‑EGFP‑CAPSID重组质粒的方法，包括以下步骤：1)将绿色荧光蛋白的基因序列与CA10所有结构蛋白的基因序列拼接；2)并将2A蛋白酶的酶切位点插入绿色荧光蛋白基因的前段；3)设计引物。一种由CA10‑EGFP‑CAPSID质粒表达的柯萨奇病毒A10结构蛋白和EV71‑LUC‑REPLICON复制子转录的EV71亚基因组RNA组装而成的假病毒以及包含该假病毒的中和抗体试剂盒。本发明提供一种安全、灵敏、快速、特异、简便且成本低廉的检测CA10中和抗体的方法，采用了单周期感染的假病毒，所以没有使用活病毒时的安全问题。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体为柯萨奇病毒A10型假病毒的包装及血清中和抗体检测方法。

背景技术

手足口病(Hand,foot and mouth disease，HFMD)是由多种肠道病毒感染引起的，以发热和手、足、口腔出现皮疹、疱疹为临床表现的传染性疾病。肠道病毒71型(Enterovirus 71,EV71)和柯萨奇病毒A组16型(Coxsackievirus A16,CA16)是最主要病原体，但近年来，有研究显示EV71和CA16的感染率呈逐年下降的趋势，而柯萨奇病毒A组6型(Coxsackievirus A6,CA6)和柯萨奇病毒A组10型(Coxsackievirus A10,CA10)等其他血清型肠道病毒的感染率却在逐年上升。CA10在部分地区已成为仅次于EV71和CA16的HFMD病原体。

柯萨奇病毒A组10型属小核糖核酸病毒科(Picornaviridae),肠道病毒属(Enterovirus)A组。CA10病毒结构相对简单，由60个结构蛋白构成的二十面体，直径23-30nm，无包膜。基因组为单股正链RNA，约7400bp，该RNA通过和内部核糖体结合进行翻译。核酸RNA主要分为四部分：5’非编码区，多聚蛋白编码区，可分为P1，P2和P3三部分，P1为结构蛋白编码区，P2和P3为功能性蛋白编码区，3’非编码区。CA10多导致轻症感染，包括HFMD、疱疹性咽峡炎(herpangina，HA)和脱甲症(Onychomadesis)等，具体表现为手、足、口腔等部位皮疹、溃疡，发热，咽痛和指甲脱落。中和抗体的检测对CA10流行病学调查研究以及疫苗研发评价有很重要意义。

如果开发一种检测CA10的血清中和抗体检测方法，对手足口病的CA10特异性检测具有重要的意义。

发明内容

为解决以上现有问题，本发明提供柯萨奇病毒A10型假病毒的包装及血清中和抗体检测方法。本发明通过以下技术方案实现。

一种用于包装柯萨奇病毒A10型假病毒的重组表达质粒，所述重组表达质粒命名为CA10-EGFP-CAPSID质粒，所述重组表达质粒具有序列表中SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。

进一步的，所述重组质粒使用绿色荧光蛋白报告基因(EGFP)，在绿色荧光蛋白基因和2A酶切位点后为CA10所有结构蛋白的编码基因(P1基因)。

进一步的，在EGFP和P1基因片段之间添加蛋白酶切位点(2A酶切位点，-AITTL-)。

更进一步的，一种表达CA10-EGFP-CAPSID重组质粒的方法，包括以下步骤：1)将绿色荧光蛋白的基因序列与CA10所有结构蛋白的基因序列拼接；2)并将2A蛋白酶的酶切位点插入绿色荧光蛋白基因的前段；3)设计引物；

所述引物序列为：

CA10-EGFP-F ACCCAAGCTGGCTAGCGCCACCATGGTGAGCAAGGGCG

CA10-EGFP-R gacttgagctccAAGGGTAGTAATGGCCTTGTAC