[发明专利]基于荧光素乙酯的ORAC抗氧化活性评价方法及荧光指示剂

说明书

基于荧光素乙酯的ORAC抗氧化活性评价方法及荧光指示剂。本发明公开了一种基于荧光素乙酯的ORAC抗氧化活性评价方法，基于荧光素乙酯的ORAC抗氧化活性评价方法无需调节pH值具有更大的适用性。适用于水溶性、脂溶性抗氧化剂，待测样品与荧光素乙酯混合均匀，以AAPH为自由基引发剂，进行抗氧化活性评价。本发明具有适用范围广、原位评价的优点。

技术领域

本发明属于功能食品和药品领域，具体涉及一种基于荧光素乙酯的ORAC抗氧化活性评价方法及荧光指示剂。

背景技术

随着对自由基的认识逐渐加深，人们对于抗氧化剂的需求越来越高，也越来越全面，因此许多新型抗氧化剂被开发出来，因此对抗氧化剂能力的测定的方法也是多种多样，更全面、更精确、更方便的方法也是人们研究的重点。抗氧化剂的测定方法主要有以下几个标准方法：氧自由基清除(或吸收)能力(ORAC)、亚铁还原能力测定(FRAP)、Trolox当量抗氧化能力测定(TEAC)、二苯基苦基苯肼(DPPH)法等。此外还有体内抗氧化活性的测定方法，包括DNA氧化损伤检测方法、线粒体氧化损伤检测方法、蛋白质氧化损伤检测方法等，体内检测方法可以更全面、综合地评估抗氧化剂的抗氧化能力，因为某些抗氧化剂可能需要在特定的部位中达到特定浓度才能起到抑制自由基的效果。

在体外实验中，ORAC法是一种适用最为广泛便捷的方法。在ORAC法中，以荧光素钠为荧光探针作为指示剂，使用偶氮化合物AAPH在热分解过程中产生的自由基作为自由基引发剂，以荧光探针荧光强度的消耗程度为指标来展示体系中的氧化程度。具体计算方式是以Trolox(维生素E类似物)作为标准物质，记录荧光强度曲线，以曲线积分面积量化比较，荧光积分面积的增大即视为抗氧化能力。ORAC法中的探针荧光强度的衰退不依赖于探针的浓度，而取决于自由基产生剂AAPH的浓度。多数样品不会影响AAPH的热分解效率，AAPH也不会与样品直接反应。

ORAC法的优点在于化学反应彻底，它的计算方法为将抗氧化剂存在时的荧光强度衰退面积与无抗氧化剂时的面积之差作为它的保护面积，以此代表抗氧化剂的绝对抗氧化能力，而将其与标准物质Trolox的面积比值作为ORAC值。但是ORAC法中的荧光探针荧光素钠对pH的变化十分敏感，在pH7时荧光强度会迅速下降，因此反应需在磷酸缓冲液中进行，以保持pH的稳定。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种基于荧光素乙酯的ORAC抗氧化活性评价方法，实现对抗氧化剂无需调节pH值进行原位评价，具有适用范围广、原位评价的优点。

传统ORAC法采用荧光素作为指示剂受到pH干扰较大，测试抗氧化剂的抗氧化能力是需要在pH在7.4左右才能发挥比较好的荧光性能，起到指示作用，而在食品中的pH可能会有多种情况出现，最常见的就是纯水的环境中，此时荧光素的荧光性能就会降低，在偏酸性的食品中同样也有可能需要抗氧化剂，在这种环境中使用荧光素作为指示剂的ORAC法就无能为力了。

荧光素的荧光强度在pH值偏酸性急剧降低的主要原因是荧光素分子中的羧基环化，破坏了荧光素的共轭结构。因此本发明中采用了荧光素乙酯，将其中的羧基酯化使得在pH值偏酸性的条件下不会出现环化现象。

一种基于荧光素乙酯的ORAC抗氧化活性评价方法，以荧光素乙酯为荧光指示剂材料，进行ORAC抗氧化活性评价。

作为优选，检测时pH为5～8。进一步优选为6-7.4。

作为优选，检测时，不需要pH值缓冲体系。当然，根据需要，也可以在pH缓冲体系中进行检测。