[发明专利]哺乳动物细胞组合表达载体、表达系统、制备方法和应用

权利要求书

1.一种哺乳动物细胞组合表达载体，其特征在于，所述表达载体上插入有如SEQ IDNO:1所示的ARE序列、如SEQ ID NO:4所示的IRES序列、如SEQ ID NO:7所示的WPRE序列以及筛选标记基因序列；所述ARE序列位于启动子上游，所述WPRE序列位于目的基因下游，所述筛选标记基因位于所述IRES序列下游，所述目的基因位于启动子与IRES序列之间，所述表达载体结构为ARE-启动子-目的基因-WPRE-IRES-BSR-PolyA；所述目的基因为乙肝疫苗基因；所BSR为杀稻瘟菌素抗性基因。

2.根据权利要求1所述的哺乳动物细胞组合表达载体，其特征在于，所述筛选标记基因序列选自如SEQ ID NO:8所示的BSR序列。

3.根据权利要求1所述的哺乳动物细胞组合表达载体，其特征在于，所述表达载体的出发载体为pIRES-neo2或pIRES-neo3。

4.权利要求1~3任一项所述的哺乳动物细胞组合表达载体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤a：PCR扩增EGFP，分别双酶切EGFP报告基因扩增产物及出发载体，回收酶切片段，连接、转化后鉴定，得到表达载体I；

步骤b：分别双酶切ARE序列和表达载体I，回收酶切片段，连接、转化后鉴定，得到表达载体II；

步骤c：将IRES序列无缝克隆到表达载体II，得到表达载体III；

步骤d：分别双酶切WPRE序列和表达载体III，回收酶切片段，连接、转化后鉴定，得到表达载体IV；

步骤e：将筛选标记基因序列无缝克隆到表达载体IV，得到哺乳动物细胞组合表达载体V。

5.包含权利要求1~3任一项所述哺乳动物细胞组合表达载体的真核细胞表达系统。

6.权利要求5所述真核细胞表达系统的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤a：将目的基因插入权利要求1~3任一项所述组合表达载体的启动子与IRES序列之间，构建得到重组表达载体；

步骤b：将重组表达载体转染进入宿主细胞，经筛选得到表达系统。

7.权利要求1~3任一项所述哺乳动物细胞组合表达载体、权利要求5所述真核细胞表达系统在制备包含目的蛋白的药物中的应用。