[发明专利]哺乳动物细胞组合表达载体、表达系统、制备方法和应用

说明书

本发明属于基因工程技术领域，公开了一种哺乳动物细胞组合表达载体、表达系统、制备方法和应用，该表达载体上插入有ARE序列、IRES序列、WPRE序列以及筛选标记基因序列，所述ARE序列如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3所示，所述IRES序列如SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6所示，组合表达载体的结构为：ARE‑启动子‑目的基因‑WPRE‑IRES‑BSR‑PolyA。该载体利用抗阻遏元件进行载体不同元件的优化组合，一方面克服转基因沉默，另一方面使目的基因在宿主细胞中高效、持久、稳定表达。

技术领域

本发明涉及一种哺乳动物细胞组合表达载体，同时还涉及包含该表达载体的表达系统、制备方法和应用，属于基因工程技术领域。

背景技术

重组蛋白是运用基因工程技术、通过将目的基因构建到表达载体，在异源细胞实现目的表达产生的蛋白。重组蛋白的生产主要包括四大系统：原核蛋白表达、酵母蛋白表达、昆虫细胞蛋白表达及哺乳动物细胞蛋白表达。结构复杂或糖基化对于活性非常重要的蛋白质，在重组蛋白生产中发挥着至关重要的作用，是当前重组药物蛋白生产中最为常用的表达系统。由于E.coli原核表达系统及低等真核生物表达系统如酵母缺乏复杂的翻译后修饰功能，因此重组蛋白药物需要在高等哺乳动物细胞中表达以具备活性。目前近70%采用中国仓鼠卵巢（Chinese hamster ovary，CHO）细胞表达系统。但是由于转基因沉默（Transgene silencing）导致的目的基因表达水平低下已经成为CHO细胞表达系统的瓶颈技术，此外还存在高产稳定细胞筛选周期长、细胞培养成本高等缺陷，这严重制约着重组蛋白药物的生产。

近年来，围绕着提高哺乳动物细胞重组蛋白的表达，研究者进行了许多有益的尝试，其中进行载体的优化是一种有效的策略，如构建表达载体时选用强启动子、使用增强子、核基质结合区、或在转基因操作时进行去甲基化处理等。但目前的载体优化大多数集中在某一元件的功能鉴定和研究，如公开号为CN104975018A的发明专利公开了一种新型增强子及其应用，该增强子特别适用于CHO细胞，在动物细胞中的外源蛋白表达量获得大幅提升，表达水平提高了约2～3倍，如公开号为201410129979.2的发明专利公开了一种新型的含MAR核心片段的动物细胞表达载体，其两端加有人工转录因子结合位点的MAR核心片段的质粒特别适用于CHO细胞，与不含两端加有人工转录因子结合位点的核基质结合区元件MAR核心片段的质粒相比，动物细胞中的外源蛋白的表达量获得大幅提高，表达量提高了10-17倍。但是这些元件在提高转基因表达水平方面仍不尽理想，另外表达载体不同元件之间具有匹配性，如MAR序列和不同启动子进行组合，其提高CHO细胞目的基因表达的水平存在差异（Ho SC, Mariati, Yeo J H, Fang S G, YangY. Impact of using differentpromoters and matrix attachment regions on recombinant protein expressionlevel and stability in stably transfected CHO cells.Mol Biotechnol. 2015;57(2):138-44），因此需要在载体不同元件之间进行优化组合，筛选出高效表达载体。

发明内容

本发明的目的在于提供一种哺乳动物细胞组合表达载体，能使目的基因在宿主细胞中高效、长期、稳定表达。

本发明的另一目的在于提供一种哺乳动物细胞组合表达载体的制备方法。

本发明的再一目的在于提供一种哺乳动物细胞组合表达载体的真核细胞表达系统，制备方法及应用。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：