[发明专利]一步法检测噻虫嗪残留的scFv-ELISA试剂盒及其应用

说明书

本发明公开了一步法检测新烟碱农药噻虫嗪残留的快速检测试剂盒及其应用，所述试剂盒包括盒体、设在盒体内的酶标板以及试剂；其中，所用酶标板的每个孔包被有噻虫嗪包被抗原，所述试剂包括抗噻虫嗪禽源scFv‑AP基因工程抗体、噻虫嗪标准溶液、缓冲液PBS、洗涤液PBST、显色液和反应终止液等。检测过程中，酶标板孔内吸附的噻虫嗪包被抗原和待测噻虫嗪与抗体发生竞争反应，通过显色反应观察结果。本发明的优点是使用一步检测法准确地检测出水、土壤、蔬菜和水果中噻虫嗪的残留量，样品前处理过程简单，耗时较少，能同时检测大量样品，样品检测成本远低于现有检测方法，与传统ELISA试剂盒相比，样品检测所需时间大大缩短。

技术领域

本发明涉及基因工程以及ELISA检测技术领域，具体地说，涉及一步法检测噻虫嗪残留的ELISA试剂盒及其应用。

背景技术

1991年，先正达公司成功研发了第二代新烟碱杀虫剂噻虫嗪(Thiamethoxam，Thi，化学结构式如图1所示)，因为其对哺乳动物的毒性较低，具有广谱杀虫活性，施药后能迅速被植物所吸收并传导至植株各组织，可用于大部分农作物防治多种咀嚼式口器害虫和刺吸式口器害虫，因而在全球范围内得到了普遍的使用，然而它的不合理应用对动植物和环境造成了危害，使得人们日益关注它在动植物及环境中的残留。气相色谱法是通过物质沸点、极性以及吸附性质等方面的差别来完成混合物分离，其优点在于分离效率高、灵敏度高和分析速度快。张芬用GC/ECD方法测定茶叶、土壤样品中的噻虫嗪残留，最低检出限是0.0025-0.01mg/kg，回收率为62％-105％。

高效液相色谱借溶质在两相间分配系数、吸附力等的不同，从而使不同溶质得以分离，它可以检测高沸点以及稳定性差的化合物。Zhou等利用HPLC方法对环境水样品中的噻虫嗪残留做了检测，最低检出限是6.1ng/mL，回收率为90.06％-110.18％；Jyot等应用HPLC方法测定棉花叶片和土壤中噻虫嗪的残留，最低检出限为0.05mg/kg，回收率为82％-97％；刘宾等应用HPLC方法检测了菠菜中噻虫嗪的残留，最低检出限为0.002mg/kg；赵文晋等应用HPLC方法对稻田土壤和及水稻中噻虫嗪进行了测定，最低检出限为0.001-0.004mg/kg，平均回收率为88.96％-100.32％。

气/液相色谱-质谱联用法(GC/LC-MS)将色谱法与质谱法联合起来可以同时达到定性和定量的功能。罗梅梅等应用LC-MS方法对韭菜中的噻虫嗪残留进行了测定，最低检出限为0.01mg/kg，平均回收率是73.7％-98.6％；许秀莹等应用GC-MS方法测定了大米中噻虫嗪等六种农药的残留，最低检出限为0.05mg/kg；聂鲲应用LC-MS方法检测蔬菜中噻虫嗪残留，最低检出限为0.0003mg/kg，平均回收率是89.9％-102.4％；聂鲲等应用GC-MS测定水果中的噻虫嗪残留，方法检出限为0.0003mg/kg，平均回收率为88.9％-100.3％。

综上所述，可知仪器检测法的优点在于其精细的前处理、精密的仪器以及其精准的数据分析，这些优势使得其在环境样品检测中得到了广泛的应用。但是正是这些优势却使其无法在现场快速检测，因为其需要昂贵的检测分析仪器、良好的实验环境以及专业的技术人员，并且检测时间久。因此一种快速的现场检测方法是很有必要的，而免疫分析方法可以满足这些要求，它具有操作简便、灵敏度高、特异性强和能够在现场快速检测。

基于常规抗体显色原理(HRP酶标二抗显色、硫酸终止反应)的噻虫嗪残留酶联免疫吸附分析方法，添加待测样品和标准品反应30-60min后，还需添加酶标二抗反应30-60min，步骤较多、耗时较长,且由于受到酶标二抗特异性和灵敏度的影响，具有稳定性相对较低的缺点。本发明以抗噻虫嗪scFv-AP基因工程抗体(单链抗体与碱性磷酸酶定向偶联后的融合表达蛋白)为基础，采用一步法酶联免疫吸附分析方法，无需酶标二抗，添加样品和和标准品反应30-60min后即可直接显色。其检测效率、热稳定性均优于常规抗体显色原理的酶联免疫分析方法。

发明内容