[发明专利]肝细胞生长因子的制备方法

权利要求书

1.一种肝细胞生长因子的制备方法，其特征在于，包括：将酶原形式的肝细胞生长因子与肝细胞生长因子激活剂混合；

所述酶原形式的肝细胞生长因子为肝细胞生长因子的α-链与肝细胞生长因子的β-链相连的多肽片段，其氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示；

所述肝细胞生长因子激活剂选自：氨基酸序列如SEQ ID NO.15所示的多肽；或氨基酸序列如SEQ ID NO.15所示，且氨基酸有一个或多个取代，但生物活性不变的多肽；或氨基酸序列如SEQ ID NO.16所示的多肽；或氨基酸序列如SEQ ID NO.16所示，且氨基酸有一个或多个取代，但生物活性不变的多肽。

2.根据权利要求1所述的肝细胞生长因子的制备方法，其特征在于，所述酶原形式的肝细胞生长因子的制备方法包括：构建表达酶原形式的肝细胞生长因子的质粒，瞬时转染至悬浮的宿主细胞中，培养；和/或

所述肝细胞生长因子激活剂的制备方法包括：构建表达肝细胞生长因子激活剂的质粒，瞬时转染至悬浮的宿主细胞中，培养。

3.根据权利要求2所述的肝细胞生长因子的制备方法，其特征在于，所述表达酶原形式的肝细胞生长因子的质粒上还含有编码肝细胞生长因子信号肽的片段，所述编码信号肽的片段与编码酶原形式的肝细胞生长因子的片段依次连接；优选地，所述编码信号肽的片段的序列如SEQ ID NO.6所示。

4.根据权利要求2所述的肝细胞生长因子的制备方法，所述表达肝细胞生长因子激活剂的质粒上还含有编码TNFR信号肽的片段，所述TNFR信号肽与所述表达肝细胞生长因子激活剂依次连接；优选地，所述编码TNFR信号肽的片段的序列如SEQ ID NO.17所示。

5.根据权利要求2所述的肝细胞生长因子的制备方法，其特征在于，所述表达酶原形式的肝细胞生长因子的质粒的构建方法包括以下步骤：

以含有HGF基因片段的DNA为模板，通过核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示的引物和核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示的引物扩增，得目的片段；

将目的片段与表达载体连接。

6.根据权利要求5所述的肝细胞生长因子的制备方法，其特征在于，所述表达载体为pMCX。

7.根据权利要求6所述的肝细胞生长因子的制备方法，其特征在于，所述目的片段插入在所述表达载体的Not I和BamH I之间。

8.根据权利要求1所述的肝细胞生长因子的制备方法，其特征在于，所述酶原形式的肝细胞生长因子与肝细胞生长因子激活剂混合的方法，包括以下步骤：

分别构建表达酶原形式的肝细胞生长因子的质粒和表达肝细胞生长因子激活剂的质粒；

将所述表达酶原形式的肝细胞生长因子的质粒转染至宿主细胞中，培养、分离纯化，得酶原形式的肝细胞生长因子；

将所述表达肝细胞生长因子激活剂的质粒转染至宿主细胞中，培养、分离纯化，得肝细胞生长因子激活剂；

将所述酶原形式的肝细胞生长因子与所述肝细胞生长因子激活剂混合。

9.根据权利要求1所述的肝细胞生长因子的制备方法，其特征在于，所述酶原形式的肝细胞生长因子与肝细胞生长因子激活剂混合的方法，包括以下步骤：

分别构建表达酶原形式的肝细胞生长因子的质粒和表达肝细胞生长因子激活剂的质粒，将所述表达酶原形式的肝细胞生长因子的质粒和表达肝细胞生长因子激活剂的质粒共转染至宿主细胞中，培养。

10.根据权利要求2-9任一项所述的肝细胞生长因子的制备方法，其特征在于，所述酶原形式的肝细胞生长因子与所述肝细胞生长因子激活剂混合的质量比为：10：1至100：1。

11.根据权利要求2-9任一项所述的肝细胞生长因子的制备方法，其特征在于，所述宿主细胞为HEK293细胞。