[发明专利]肝细胞生长因子的制备方法

说明书

本发明提供了一种肝细胞生长因子的制备方法，包括：将酶原形式的肝细胞生长因子与肝细胞生长因子激活剂混合；所述酶原形式的肝细胞生长因子为肝细胞生长因子的α‑链与肝细胞生长因子β‑链直接相连的多肽片段；所述肝细胞生长因子激活剂选自：氨基酸序列如SEQ ID NO.15所示的多肽；或氨基酸序列如SEQ ID NO.15所示，且氨基酸有一个或多个取代，但生物活性不变的多肽；或氨基酸序列如SEQ ID NO.16所示的多肽；或氨基酸序列如SEQ ID NO.16所示，且氨基酸有一个或多个取代，但生物活性不变的多肽。解决了成熟形式的肝细胞生长因子不易表达，难以大规模生产，应用受到限制的问题。

技术领域

本发明属于生物医学技术领域，特别涉及一种肝细胞生长因子的制备方法。

背景技术

肝细胞生长因子(Hepatocyte growth factor，HGF)被认为是血清中促进肝再生的生长因子。HGF是以无活性的酶原形式分泌至细胞外，随后被丝氨酸蛋白酶切割成成熟的异二聚体，此二聚体由二硫键连接的69kDaα-亚基和34kDaβ-亚基组成。HGF影响不同组织包括肝、肺、肾、肠、心血管系统的形态发生、细胞迁移、器官再生、肿瘤入侵。

在近期的研究中也揭示了HGF在不同疾病中潜在的药用价值，如肝纤维化和肝硬化、肾纤维化、肺纤维化、闭塞性动脉硬化等等。因此开发重组HGF对于医疗应用具有重要意义。然而，传统常用的大肠杆菌表达重组HGF，纯化时需经过变性复性过程，其过程较复杂不利于大规模生产，酵母表达的重组HGF其修饰程度并未完全接近于天然存在的HGF，其药效还未可知。另一方面，HGF重组质粒打进人体后，由于个体的差异，其表达也将存在差异，无法保证药效的一致性。而哺乳动物细胞表达的蛋白质，其修饰程度非常接近天然形式HGF，因此在哺乳动物细胞中进行HGF表达具有潜在的应用价值。

HGF根据其是否加工成熟可以进一步细分为HGF酶原形式(HGF pro)和HGF成熟形式(HGF mature)。在实际应用中，不易直接体外表达得到具有良好生物活性的HGF matrue，可以采用体外重组表达HGFpro的方法获取HGF，理论上，HGF pro被注射到生物体内后有可能在血液中转化为具有生物活性的HGF mature，从而发挥药效。但由于生物体代谢的复杂性和个体的差异性，其转化效率存在差异，若用于药物治疗可能会导致药效的不稳定性和延迟性。而且，随着细胞治疗技术的发展，如干细胞治疗，CAR-T，考虑到血清的高风险性，其对培养基的无动物源性有越来越高的要求，无生物活性的HGF pro在无血清的条件下无法转化为成熟形式的HGF，因此将在上述这些领域的应用受到限制。

发明内容

基于此，本发明的目的在于提供一种肝细胞生长因子的制备方法，实现能够高效、稳定地制备得到具有生物活性的成熟形式的HGF。

为实现上述目的，本发明具体技术方案如下：

一种肝细胞生长因子的制备方法，包括：将酶原形式的肝细胞生长因子与肝细胞生长因子激活剂混合；

所述酶原形式的肝细胞生长因子为肝细胞生长因子的α-链与肝细胞生长因子β-链直接相连的多肽片段，其氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示；

所述肝细胞生长因子激活剂选自：氨基酸序列如SEQ ID NO.15所示的多肽；或氨基酸序列如SEQ ID NO.15所示，且氨基酸有一个或多个取代，但生物活性不变的多肽；或氨基酸序列如SEQ ID NO.16所示的多肽；或氨基酸序列如SEQ ID NO.16所示，且氨基酸有一个或多个取代，但生物活性不变的多肽。

在其中一些实施例中，所述酶原形式的肝细胞生长因子的制备方法包括：构建表达酶原形式的肝细胞生长因子的质粒，瞬时转染至悬浮的宿主细胞细胞中，培养；和/或

所述肝细胞生长因子激活剂的制备方法包括：构建表达肝细胞生长因子激活剂的质粒，瞬时转染至悬浮的宿主细胞细胞中，培养。