[发明专利]一种Marc-145全悬浮细胞直接培养猪蓝耳病病毒疫苗的方法

权利要求书

1.一种Marc-145全悬浮细胞直接培养猪蓝耳病病毒疫苗的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

(a)Marc-145细胞的驯化培养，所述驯化培养为Marc-145细胞由贴壁培养驯化为悬浮培养同时将Marc-145细胞由含血清培养基培养驯化为无血清培养基进行培养；

(b)取细胞状态良好并经驯化后Marc-145悬浮细胞经摇瓶进行扩大培养，待细胞状态稳定，生长良好后接种于2L～8L的生物反应器中进行预培养，随后根据细胞状态，生长情况，逐步放大培养直至终级反应器；

(c)待终级反应器细胞密度达到8.0×10^6.0～10.0×10^6.0个/ml，同时细胞状态稳定，调整反应器细胞密度，使其达到4.0×10^6.0～5.0×10^6.0个/ml，按MOI 0.1～1.0接种猪蓝耳病毒至Marc-145悬浮细胞中，猪蓝耳病毒的含量为每0.1ml病毒含量≥10^8.5TCID₅₀，培养至细胞病变达80％以上时收获病毒液；

(d)将收获的病毒液进行纯化、灭活后得灭活疫苗。

2.根据权利要求1所述的Marc-145全悬浮细胞直接培养猪蓝耳病病毒疫苗的方法，其特征在于，所述步骤(a)中将Marc-145细胞由贴壁培养驯化为悬浮培养同时将含血清培养基培养驯化为由无血清培养基进行培养的方法为：

(1)贴壁Marc-145细胞用胎牛血清含量为7～10％的MEM培养基连续传代培养2次；

(2)使用胰酶消化Marc-145细胞、低速离心，得到的细胞用无血清悬浮培养基并加入7～10％的胎牛血清以转速为40-60r/min进行摇床培养，接种密度以1.0×10⁶～1.5×10⁶个/ml连续传代培养4次；

(3)无血清悬浮培养基并加入4～6％的胎牛血清以转速为60-80r/min进行摇床培养，接种密度以0.8×10⁶～1.2×10⁶个/ml连续传代培养4次；

(4)无血清悬浮培养基并加入1～2％的胎牛血清以转速为80-100r/min进行摇床培养，接种密度以0.6×10⁶～0.8×10⁶个/ml连续传代培养4次；

(5)无血清悬浮培养基以转速为100-140r/min进行摇床培养，接种密度以0.6×10⁶～0.8×10⁶个/ml连续传代培养4次；

(6)；无血清悬浮培养基以转速为100-140r/min进行摇床培养，接种密度以0.45 ×10⁶～0.65×10⁶个/ml连续传代培养4次。

3.根据权利要求2所述的Marc-145全悬浮细胞直接培养猪蓝耳病病毒疫苗的方法，其特征在于，所述Marc-145细胞进行摇床培养时每一代的培养时间为72-120小时。

4.根据权利要求1所述的Marc-145全悬浮细胞直接培养猪蓝耳病病毒疫苗的方法，其特征在于，所述步骤(b)中进行摇瓶扩大培养时，每次放大时细胞密度不低于0.45×10⁶～0.65×10⁶个/ml，放大体系为由20ml摇瓶逐级放大至50ml至100ml至150ml的摇瓶。

5.根据权利要求1、2、3、4任一所述的Marc-145全悬浮细胞直接培养猪蓝耳病病毒疫苗的方法，其特征在于，所述步骤(d)中将收获的病毒液进行纯化的方法为将收获的病毒液采用中空纤维柱进行澄清、微滤、浓缩80-100倍后，采用分子筛层析柱对滤液进行纯化；将收获的病毒液进行灭活的方法为采用β-丙内酯灭活纯化的病毒液后，加入常规稳定剂1:1混合配制成灭活疫苗。

6.根据权利要求5所述的Marc-145全悬浮细胞直接培养猪蓝耳病病毒疫苗的方法，其特征在于，所述猪蓝耳病灭活疫苗为PRRS，所述PRRS为CH-1a株，包括且不限于此毒株。