[发明专利]一种Marc-145全悬浮细胞直接培养猪蓝耳病病毒疫苗的方法

说明书

本发明涉及猪蓝耳病病毒疫苗制备领域，特别涉及一种Marc‑145全悬浮细胞直接培养猪蓝耳病病毒疫苗的方法，本发明公开了Marc‑145单层细胞驯化至悬浮培养的方法，实现了Marc‑145细胞在培养基中的全悬浮培养，因而采用猪蓝耳病毒直接接种于Marc‑145悬浮细胞培养，并利用生物反应器扩大培养，培养的猪蓝耳病毒疫苗增殖速度稳定，病毒含量≥10^8.5TCID₅₀；培养至细胞病变达80％以上时收获病毒液，即得。本发明将猪蓝耳病毒直接接种于Marc‑145悬浮细胞驯化培养，有效增加生产得到的悬浮病毒的稳定性、连续性与安全性，并利用生物反应器放大培养，每0.1ml病毒含量≥10^8.5TCID₅₀，进一步提高了猪蓝耳病疫苗的质量和产量。

技术领域

本发明涉及兽用生物制药技术领域，具体涉及一种Marc-145全悬浮细胞直接培养猪蓝耳病病毒疫苗的方法。

背景技术

Marc-145细胞即猴胚胎肾上皮细胞，来源于猴肾细胞，是母细胞(MA104 细胞)的克隆株，贴壁依赖性生长，可连续传代培养，无致瘤性，该细胞株经过数次悬浮驯化得到悬浮适应株，可不依赖于载体悬浮生长。该细胞对猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)特别敏感，目前广泛用于猪蓝耳病疫苗的生产。

猪蓝耳病(PRRS)，又称为神秘猪病、新猪病、猪流行性流产和呼吸综合症、猪生殖与呼吸综合症、猪蓝耳病、猪瘟疫等，是我国猪病中最主要的一种免疫抑制病，主要引起怀孕母猪后期流产、早产、产死胎和木乃伊胎增多，仔猪出现呼吸道症状和断奶前死亡率增高以及成年猪的免疫机障碍。猪蓝耳病病毒 (PRRSV)属于套式病毒目、动脉炎病毒科，呈卵圆形，有囊膜，基因组为单股正链RNA病毒；该病毒的主要靶细胞是单核细胞-巨噬细胞系统，目前普遍认为该病毒的初级复制部位是鼻黏膜或上呼吸道系统中的巨噬细胞，然后通过血液循环扩散至其他器官，并在其中的单核巨噬细胞系统内增殖。

目前我国动物疫苗生产工艺相对落后，生产病毒所用的细胞绝大部分来自转瓶培养，且主要采用最基础的合成细胞培养基，甚至天然培养基(如水解乳蛋白)加入10％左右新生牛血清,这些动物来源成分带来的疫苗安全、质量和成本等问题已经凸显。主要表现在：①牛血清用量大，使细胞的生长状况对血清的依赖性大，但是血清是一种成分不确定的混合物，批与批之间的组分存在差异，直接影响产品质量的稳定性；②增加生产成本；③血清来源于动物，有可能携带传染源，对正在生长的细胞或者产品带来危险。在生产过程中控制和减少动物来源成分已成为一种趋势。美国FDA和美国农业部已经严密控制在细胞培养中胎牛血清的使用，以降低动物血清可能携带的传染源对细胞和制品带来的风险。降低新生牛血清的用量甚至不使用新生牛血清已成为目前生物制品发展的方向。

猪蓝耳病是一种高度接触性传染病，各种品种、不同年龄和用途的猪均可感染，但以妊娠母猪和1月龄以内的仔猪最易感染。患病猪和带毒猪是本病的重要传染源，主要传播途径是接触感染、空气传播和精液传播，也可通过胎盘垂直传播。

目前，猪蓝耳病的主要防治手段是是接种疫苗，但是在实践过程中，猪蓝耳病疫苗防治经常会出现免疫失败，其主要原因是疫苗免疫时，机体产生中和抗体时间较长，或不能产生高效价的抗体，而在此期间均有可能感染猪蓝耳病毒。

发明内容

为解决现有技术中存在的问题，本实发明专利设计了一种Marc-145全悬浮细胞直接培养猪蓝耳病疫苗的方法，是将猪蓝耳病毒直接接种于Marc-145全悬浮细胞进行培养，就可直接获得病毒液(半成品)，解决了猪蓝耳病毒疫苗大规模细胞培养的批间差等一系列问题。

本发明所提供的使用Marc-145全悬浮细胞直接培养猪蓝耳病疫苗的方法的技术方案为：

(a)Marc-145细胞的驯化培养，所述驯化培养为Marc-145细胞由贴壁培养驯化为悬浮培养同时将Marc-145细胞由含血清培养基培养驯化为无血清培养基进行培养；