[发明专利]一种PD1基因过表达稳转株及其构建方法

权利要求书

1.一种PD1基因过表达稳转株及其构建方法，其特征在于：所述PD1基因过表达稳转株及其构建方法包括下列步骤：

步骤1:细胞培养；

步骤2:PRKACB基因的PCR扩增；

步骤3:pEGFP-C1-PRKACB真核载体的构建和鉴定；

步骤4:重组载体pEGFP-C1-PRKACB PCR和酶切鉴定；

步骤5:新霉素筛选稳定转染pEGFP-C1-PRKACB细胞株。

2.如权利要求1所述PD1基因过表达稳转株及其构建方法，其特征在于：所述步骤1:细胞培养，将LTEP-a-2细胞用含10％胎牛血清的RPMI-1640培养基37C，5％CO2孵箱中培养。

3.如权利要求1所述的PD1基因过表达稳转株及其构建方法，其特征在于：所述步骤2:PRKACB基因的PCR扩增，细胞总RNA的提取及RT-PCR分别按Trizol和RT-PCR试剂盒的说明书进行，逆转录得到cDNA，以cDNA为模板扩增得到PRKACB基因片段；PRKACB上游引物5′-GCGCAAGCTTGTATG-CCACCTTATAGAGAA-3′；下游引物5′-GCGCGGATCCTTA-AAATTCACCAAATTC-3′；PCR反应条件:94C2min，94C45s，57C45s，72C90s，30个循环，72C10min，PCR产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳后采用凝胶试剂盒回收片段。

4.如权利要求1所述的PD1基因过表达稳转株及其构建方法，其特征在于：所述步骤3：pEGFP-C1-PRKACB真核载体的构建和鉴定，用HindⅢ/BamHI对PRKACB及质粒pEGFP-C1进行双酶切后回收产物；用TaKaRaDNALigaionKit将酶切后PRKACB与空质粒连接，转化E.coliDH5a，37℃过夜培养，筛选阳性克隆并提取质粒进行酶切、测序鉴定；转染前1天接种LTE-a-2细胞，密度达到80％左右融合，按照LipofectamineLTX&PLUS转染试剂说明进行瞬时转染；以空载体转染为对照，荧光显微镜下观察转染效率；用TRizol法提取细胞RNA逆转录得到cDNA，操作步骤按TaKaRaRNAKit说明书进行，内参GAPDH引物为上游5'-CCACCCTCAAGCCTGAGAA-3′；下游5′-GGTGAACACGCCAGTGGA-3′；Westemblot检测用lysisbuffer提取组织总蛋白，将含80μg总蛋白的裂解产物进行SDS-PACE电泳后，转印至PVDF膜，血清封闭，PRKACB(1:500)-抗4C孵育过夜，二抗室温孵育2h，ECL显色，结果经自动电泳凝胶成像分析仪采集，进行灰度值测定，用PRKACB和CAPDH条带的积分光密度比值表示PRKACB蛋白的相对含量。

5.如权利要求1所述的PD1基因过表达稳转株及其构建方法，其特征在于：所述步骤4:重组载体pEGFP-C1-PRKACB PCR和酶切鉴定，应用HindIl/BamHI对PRKACB及pEGFP-CI进行双酶切后连接，提取连接后的质粒，对质粒pECFP-C1一PRKACB进行双酶切鉴定并电泳见4.7kbp和1.2kbp两个条带，对pEGFP-C1-PRKACB质粒进行测序，结果与参考序列完全一致，表明pEGFP-C1-PRKACB质粒构建成功。

6.如权利要求1所述的PD1基因过表达稳转株及其构建方法，其特征在于：所述步骤5:新霉素筛选稳定转染pEGFP-C1-PRKACB细胞株，将重组pEGFP-C1-PRKACB及空载体pECFP-CI转染至LTEP-a-2细胞，经C418(400μg/ml)筛选2周后，大多数细胞死亡，仅少数细胞存活并形成克隆；用半量C418(200ug/ml)筛选，收集细胞并行Westermblot检测，根据Westermblot结果筛选PRKACB蛋白上调最显著的细胞株。