[发明专利]一种PD1基因过表达稳转株及其构建方法

说明书

本发明提供一种PD1基因过表达稳转株及其构建方法，本发明属于PD1基因构建技术领域，包括下列步骤：步骤1:细胞培养；步骤2:PRKACB基因的PCR扩增；步骤3:pEGFP‑C1‑PRKACB真核载体的构建和鉴定；步骤4:重组载体pEGFP‑C1‑PRKACB PCR和酶切鉴定；步骤5:新霉素筛选稳定转染pEGFP‑C1‑PRKACB细胞株。本发明，通过RT‑PCR和Westem blot证实pECFP‑CI一PRKACB瞬时转染LTEP‑a‑2后上调PRKACB基因mR.NA和蛋白水平的表达升高；根据Westernblot结果筛选出PRKACB蛋白上调最显著的稳定转染细胞株。

技术领域

本发明属于PD1基因构建技术领域，具体涉及PD1基因过表达稳转株及其构建方法。

背景技术

程序性细胞死亡蛋白1(Programmedcelldeathprotein1，以下简称PD-1)是由PDCD1基因也叫CD279基因编码的蛋白，为免疫球蛋白超家族中的细胞膜蛋白成员之一，是典型的由268个氨基酸组成的I型膜蛋白。PD-1是CD28/CTLA4家族中的T细胞调节因子之一，其结构包括一个胞外的IgV结构域，其后紧跟着一个跨膜结构域和一个胞内末端。PD1最初是在凋亡的T细胞杂交瘤中得到的，由于其和细胞凋亡相关而被命名为程序性死亡-1受体。PD-L1与其T细胞上的受体PD-1相互作用，在免疫应答负调控方面发挥着重要作用，该分子具有广泛的组织表达谱，在一些肿瘤细胞系上有较高的表达，许多研究均表明其于肿瘤的免疫逃逸机制相关。肿瘤部位的微环境可诱导肿瘤细胞上的PD-L1的表达，且广范表达，表达的PD-L1有利于肿瘤的发生和生长，诱导抗肿瘤T细胞的凋亡。因此通过阻断PD-L1/PD-1信号通路可有效抑制肿瘤生长，可根据此设计新的对肿瘤免疫逃逸的治疗方案，来加强T细胞对肿瘤的杀伤作用。

发明内容

本发明的目的在于提供一种膜表达人PD-1蛋白的稳转株细胞构建方法，旨在解决现有技术蛋白水平的表达低下、转染细胞株不稳定的问题。提供一种PD1基因过表达稳转株及其构建方法。

本发明所采用的技术方案是：

一种PD1基因过表达稳转株及其构建方法包括下列步骤：

步骤1:细胞培养；

步骤2:PRKACB基因的PCR扩增；

步骤3:pEGFP-C1-PRKACB真核载体的构建和鉴定；

步骤4:重组载体pEGFP-C1-PRKACB PCR和酶切鉴定；

步骤5:新霉素筛选稳定转染pEGFP-C1-PRKACB细胞株。

所述步骤1:细胞培养，将LTEP-a-2细胞用含10％胎牛血清的RPMI-1640培养基37C，5％CO2孵箱中培养。

所述步骤2:PRKACB基因的PCR扩增，细胞总RNA的提取及RT-PCR分别按Trizol和RT-PCR试剂盒的说明书进行，逆转录得到cDNA，以cDNA为模板扩增得到PRKACB基因片段；PRKACB上游引物5′-GCGCAAGCTTGTATG-CCACCTTATAGAGAA-3′；下游引物5′-GCGCGGATCCTTA-AAATTCACCAAATTC-3′；PCR反应条件:94C2min，94C45s，57C45s，72C90s，30个循环，72C10min，PCR产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳后采用凝胶试剂盒回收片段。