[发明专利]一种H5亚型禽流感病毒的等温扩增检测方法

说明书

本发明的目的是提供一种H5亚型禽流感病毒RT‑RAA检测方法，其中使用的引物对的正向引物的序列为SEQ ID NO:1，反向引物的序列为SEQ ID NO:2，探针的序列为SEQ ID NO:3。本发明提供一种基于分子生物学的快速检测H5亚型禽流感病毒的方法，以实现对H5亚型禽流感病毒进行安全、特异、快速、灵敏、简单、高通量的快速检测，从而弥补现有传统检测技术的不足。并且此方法非常适用于现场快速检测，与PCR法相比，RT‑RAA法是在恒温下反应，操作简单，摆脱了复杂仪器的束缚，不需变温，大大缩短了反应时间。

技术领域

本发明属于病毒检测技术领域，具体涉及一种H5亚型禽流感病毒的等温扩增检测方法，即一种禽流感病毒逆转录重组酶介导等温扩增(Reverse transcriptionrecombinase-aided amplification，RT-RAA)检测方法，包括鉴定H5亚型禽流感病毒的引物对和探针。

背景技术

禽流感病毒(Avian influenza virus，AIV)为单股负链RNA病毒，由8个独立的RNA节段组成，显著的生物学特征之一是亚型众多，变异频繁。迄今为止从禽类体内已经分离到上千种毒力各异的毒株，根据其病毒粒子表面的血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)的抗原性差异，分为18种HA亚型(H1-H18)和11种NA亚型(N1-N11)。

Perroncito于1878年在意大利首次报道了H5亚型高致病性禽流感。H5亚型禽流感的发生给养禽业造成严重危害。禽流感爆发对中国家禽养殖农户的生计造成了巨大的冲击，农户的家禽养殖收入和家庭收入均显著下降。H5亚型禽流感病毒还可感染人，可造成人的发病和死亡的公共卫生问题。1997年，我国香港地区首次报道禽流感病毒直接感染人至发病和死亡。此次疫情是高致病性H5N1亚型禽流感病毒首次跨越种属屏障，由家禽感染人类，共计报告18例病例，其中6例死亡。2003年初，香港又再次出现2例人感染H5N1高致病性禽流感个案，其中1例死亡。之后的1年多，人感染H5N1高致病性禽流感病例在东南亚地区多个国家相继出现，包括越南、泰国、中国大陆、柬埔寨。世界卫生组织报道，至2014年全球总共发生感染H5N1禽流感的病例达649例，其中死亡385例，死亡率高达59.32％。近年来，我国主要流行是第7分支、2.3.2.1分支和2.3.4.4分支等，但随着H5亚型禽流感病毒变异速率加快，以往的检测方法可能不能满足实际检测需求，因此需要能够检测所有流行毒株的检测方法，而能够覆盖所有流行毒株的恒温快速检测方法更是满足了现场检测需求，可以为H5亚型禽流感的预防监测提供助力。

发明内容

本发明的目的是提供一种H5亚型禽流感病毒RT-RAA检测方法，以实现对禽流感病毒进行安全、特异、灵敏、快速、方便的检测。

本发明首先提供一种检测H5亚型禽流感病毒引物对和探针组，分别是鉴定禽流感病毒HA基因的引物对H5 forward、H5reverse和探针组H5

probe，其引物对和探针序列信息如下：

正向引物H5 forward：

5′-CAGTTTGAGGCYGTTGGAAGGGAATTTAAYAA-3′(SEQ ID NO:1)

反向引物H5reverse：

5′-CTTGTCRTAAAGGTTCTTGACATTTGAGTCAT-3′(SEQ ID NO:2)

探针H5probe：

5′-CTAGATGTCTGGACTTATAATGCTGAACTTTGGTTCTCATGGAAAAT-3′(SEQ ID NO:3)

其中探针自5′端起第30位碱基T标记FAM发光基团，第30位碱基后连接脱碱基位点四氢呋喃(Tetrahydrofuran，THF)，第31位碱基T标记BHQ1淬灭基团，3′端进行C3-spacer阻断修饰。