[发明专利]一种构建高产谷胱甘肽重组菌株的方法及应用

权利要求书

1.一种构建高产谷胱甘肽重组菌株的方法，其特征为以任一可以合成谷氨酸的谷氨酸合成菌株，通过引入外源谷胱甘肽合成基因gshF或gshA和gshB基因，构建谷胱甘肽合成菌；强化该重组菌中半胱氨酸代谢途径，构建无需外源半胱氨酸与谷氨酸添加的谷胱甘肽高产菌株。

2.根据权利要求1所述的一种构建高产谷胱甘肽重组菌株的方法，其特征在于谷胱甘肽合成途径的引入通过质粒上过表达来源无乳链球菌的gshF基因或来源大肠杆菌的gshA和gshB基因实现。

3.根据权利要求1所述的一种构建高产谷胱甘肽重组菌株的方法，其特征在于半胱氨酸合成途径强化方法包括半胱氨酸降解途径和半胱氨酸合成前体丝氨酸降解途径的阻断、半胱氨酸合成抑制因子的敲除以及半胱氨酸与半胱氨酸合成前体丝氨酸合成途径的强化。

4.根据权利要求3所述的一种构建高产谷胱甘肽重组菌株的方法，其特征在于半胱氨酸降解途径和半胱氨酸合成前体丝氨酸降解途径的阻断、半胱氨酸合成抑制因子的敲除以及半胱氨酸与半胱氨酸合成前体丝氨酸合成途径的强化具体包括相关代谢途径基因的单一或组合改造。

5.根据权利要求4所述的一种构建高产谷胱甘肽重组菌株的方法，其特征在于相关代谢途径基因的单一或组合改造，包括半胱氨酸降解途径基因aecD的敲除，半胱氨酸合成前体丝氨酸降解途径基因sdaA敲入来源大肠杆菌半胱氨酸合成途径基因cysE和cysk，半胱氨酸合成抑制因子mcbR基因的敲除，来源拟南芥的对半胱氨酸浓度不敏感的cysE基因质粒过表达，以及半胱氨酸合成前体丝氨酸合成途径中来源谷氨酸棒杆菌的对丝氨酸脱敏的截短serA基因与pgk基因的质粒过表达。

6.根据权利要求1所述的一种构建高产谷胱甘肽重组菌株的方法，其特征在于任一可以合成谷氨酸的谷氨酸合成菌株，包括谷氨酸棒杆菌ATCC13032，谷氨酸棒杆菌B253，谷氨酸棒杆菌R，谷氨酸棒杆菌CGMCC 1.15647，谷氨酸棒杆菌CCTCC AB 93110，谷氨酸棒杆菌CCTCC AB 2013340。

7.权利要求1所述的构建高产谷胱甘肽重组菌株的应用，其特征在于鉴于谷氨酸棒杆菌自身可以合成大量谷氨酸，半胱氨酸途径已被强化，发酵过程中仅需添加甘氨酸即可高产谷胱甘肽。

8.用权利要求1所述高产谷胱甘肽重组菌株生产谷胱甘肽的方法，其特征在于：挑取活化过的单菌落于1～100mL种子培养基，25～37℃、50～500rpm培养5～30h，按0.1～30％接种量转接1～500mL种子培养基，25～37℃、50～500rpm培养5～30h，然后按初始OD₆₀₀为0.1～3转至1～10L/3～50L发酵罐；通过流加氨水调节pH至5.0～8.0，通过控制转速和曝气率控制溶氧为10～50％；对数前期添加0～100mM甘氨酸，对数中期添加0～100mM甘氨酸和0～20g/L硫代硫酸钠；谷胱甘肽产量可达50～2000mg/L。

种子培养基：1～20g/L葡萄糖，0.5～2g/L酵母提取物，1～5g/L蛋白胨，1～3g/L(NH₄)₂SO₄，0.1～1g/L K₂HPO₄，0.1～1g/L KH₂PO₄；

发酵培养基：1～40g/L葡萄糖，0.5～2g/L酵母提取物，1～7g/L蛋白胨，1～7g/L(NH₄)₂SO₄，0.1～1g/L K₂HPO₄，0.1～1g/L KH₂PO₄，0.1～1g/L MgSO₄·7H₂O，1～10mg/L FeSO₄·7H₂O，1～10mg/L MnSO₄·H₂O，0～10mg/L生物素，0～10mg/L硫胺素。