[发明专利]一种构建高产谷胱甘肽重组菌株的方法及应用

说明书

一种构建高产谷胱甘肽重组菌株的方法与应用，属于生物工程领域。本发明提供的高产谷胱甘肽的重组菌株方法的特征在于：以自身大量合成谷氨酸的谷氨酸棒杆菌为出发菌株，引入来源无乳链球菌的gshF基因或来源大肠杆菌的gshA和gshB基因赋予谷胱甘肽合成能力；进一步基因组缺失基因aceD，mcbR和sdaA；同时表达截短的serA基因，pgk基因，来源大肠杆菌的cysE基因和cysK基因，来源拟南芥的cysE基因，强化半胱氨酸途径；鉴于谷氨酸棒杆菌株自身可以合成大量谷氨酸，半胱氨酸途径已被强化，获得的工程菌发酵过程中仅需添加甘氨酸即可高产谷胱甘肽。

技术领域

一种构建高产谷胱甘肽重组菌株的方法与应用，属于生物工程领域，具体涉及一种高产谷胱甘肽的方法。

技术背景

迄今为止，谷胱甘肽(GSH)主要通过微生物发酵合成。鉴于野生菌中GSH产量低，基因工程和代谢工程的手段被广泛应用酿酒酵母，巴斯德毕赤酵母，产朊假丝酵母和大肠杆菌等发酵宿主中强化GSH的合成。然而均需要添加三种前体氨基酸达到高产GSH的目的。谷氨酸棒杆菌属由于可以自身大量合成谷氨酸，以其作为宿主，可以免去GSH合成前体谷氨酸的添加。此外，作为GSH另一必需前体，半胱氨酸价格相对昂贵，并且作为底物添加时易被氧化。在谷氨酸棒杆菌中，由基因cysE编码的丝氨酸乙酰转移酶和由基因cysK编码的半胱氨酸合成酶可以催化L-丝氨酸向半胱氨酸的转化，且据报道，经过代谢改造，丝氨酸合成可达30-43g/L。因此，可以通过尝试强化丝氨酸和半胱氨酸途径达到谷氨酸棒杆菌合成GSH过程中不添加或少添加L-半胱氨酸的目的。

发明内容

本发明的第一个目的在于提供一种构建高产谷胱甘肽重组菌株的方法。为此，本发明采用以下技术方案：

一种构建高产谷胱甘肽重组菌株的方法，其特征为以任一可以合成谷氨酸的谷氨酸合成菌株，通过引入外源谷胱甘肽合成基因gshF或gshA和gshB基因，构建谷胱甘肽合成菌；强化该重组菌中半胱氨酸代谢途径，构建无需外源半胱氨酸与谷氨酸添加的谷胱甘肽高产菌株。

进一步地，谷胱甘肽合成途径的引入通过质粒上过表达来源无乳链球菌的gshF基因或来源大肠杆菌的gshA和gshB基因实现。

进一步地，半胱氨酸合成途径强化方法包括半胱氨酸降解途径和半胱氨酸合成前体丝氨酸降解途径的阻断、半胱氨酸合成抑制因子的敲除以及半胱氨酸与半胱氨酸合成前体丝氨酸合成途径的强化。

进一步地，半胱氨酸降解途径和半胱氨酸合成前体丝氨酸降解途径的阻断、半胱氨酸合成抑制因子的敲除以及半胱氨酸与半胱氨酸合成前体丝氨酸合成途径的强化具体包括相关代谢途径基因的单一或组合改造。

进一步地，相关代谢途径基因的单一或组合改造，包括半胱氨酸降解途径基因aecD的敲除，半胱氨酸合成前体丝氨酸降解途径基因sdaA敲入来源大肠杆菌半胱氨酸合成途径基因cysE和cysk，半胱氨酸合成抑制因子mcbR基因的敲除，来源拟南芥的对半胱氨酸浓度不敏感的cysE基因质粒过表达，以及半胱氨酸合成前体丝氨酸合成途径中来源谷氨酸棒杆菌的对丝氨酸脱敏的截短serA基因与pgk基因的质粒过表达。

进一步地，任一可以合成谷氨酸的谷氨酸合成菌株，包括谷氨酸棒杆菌ATCC13032，谷氨酸棒杆菌B253，谷氨酸棒杆菌R，谷氨酸棒杆菌CGMCC 1.15647，谷氨酸棒杆菌CCTCC AB 93110，谷氨酸棒杆菌CCTCC AB 2013340。

本发明还提供了所述的构建高产谷胱甘肽重组菌株的应用，鉴于谷氨酸棒杆菌自身可以合成大量谷氨酸，半胱氨酸途径已被强化，发酵过程中仅需添加甘氨酸即可高产谷胱甘肽。