[发明专利]单管型多重微生物检测体系及其即时检测方法

权利要求书

1.一种单管型多重微生物检测体系，其特征在于：包括至少1种信号转换序列模板、1种信号扩增序列模板、DNA聚合酶、切刻内切酶、缓冲溶液、DNA解旋酶和/或随机六引物以及指示剂。

2.根据权利要求1所述的单管型多重微生物检测体系，其特征在于：所述信号转换序列模板和信号扩增序列模板为DNA单链核酸，且所述信号转换序列模板和信号扩增序列模板的3＇末端具有化学修饰。

3.根据权利要求2所述的单管型多重微生物检测体系，其特征在于：所述化学修饰包括修饰2个颠倒的胸腺嘧啶idT。

4.根据权利要求1所述的单管型多重微生物检测体系，其特征在于：每一所述信号转换序列模板由3段序列组成，从5＇到3＇依次为信号分子序列、第一切刻酶识别序列和病原微生物识别序列。

5.根据权利要求4所述的单管型多重微生物检测体系，其特征在于：每一所述病原微生物识别序列分别对应一种病原微生物，每一所述病原微生物识别序列的多个位置引入人工核苷酸，所述人工核苷酸包括但不限于锁核酸。

6.根据权利要求1所述的单管型多重微生物检测体系，其特征在于：所述信号扩增序列模板由3段序列组成，从5＇到3＇依次为第一信号分子互补序列、第二切刻酶识别序列和第二信号分子互补序列。

7.根据权利要求1所述的单管型多重微生物检测体系，其特征在于：所述DNA聚合酶采用具有DNA聚合延伸、RNA逆转录和链置换能力的DNA聚合酶，包括但不限于DNA聚合酶Bst。

8.根据权利要求1所述的单管型多重微生物检测体系，其特征在于：所述切刻内切酶包括但不限于Nb·BbvCI，所述指示剂包括但不限于羟基萘酚蓝的镁离子金属指示剂。

9.根据权利要求1～7任一所述检测体系的即时检测方法，其特征在于：包括以下步骤：

步骤一，配制检测体系：配制多种检测体系，包括具有多个信号转换序列模板的检测体系和多个具有1个信号转换序列模板的检测体系，每一个信号转换序列对应一种病原微生物，将每一所述检测体系组分配好后冻干，密封于石蜡中，并置于反应管中，反应管中加入水；

步骤二，初步筛查：将具有多个信号转换序列模板的检测体系的反应管加热至47～64℃，使石蜡熔化，检测体系组分溶解于水，输入外界待检测标本，在该检测体系的反应下，观察反应管中的颜色变化，即可得出待检测标本是否具备病原微生物，如检测出具备病原微生物则执行步骤三；

步骤三，进一步筛查：将每一个具有1个信号转换序列模板的检测体系的反应管加热至47～64℃，使石蜡熔化，检测体系组分溶解于水，输入外界待检测标本，在每一所述检测体系的反应下，观察反应管中的颜色变化，即可得出待检测标本对应的病原微生物的种类。

10.根据权利要求9所述检测体系的即时检测方法，其特征在于：所述检测体系与待检测标本中的病原微生物的反应包括如下步骤：

步骤一一：标本中含有的病原微生物的特征游离核酸-双链DNA被DNA解旋酶降解成长度、大小不等单链DNA片段；或病原微生物的RNA在随机六引物的作用下逆转录成单链DNA；

步骤一二：以步骤一一得到的病原微生物的单链DNA序列作为信号输入，互补结合于信号转换序列模板的病原微生物识别序列，在DNA聚合酶的作用下继续延伸；

步骤一三：切刻内切酶识别信号转换序列模板中双链状态的第一切刻酶识别序列，并切刻DNA链，产生一个切刻缺口；

步骤一四：切刻内切酶产生的切口，在DNA聚合酶的作用下，切口右边的3＇端单链继续延长，同时切口左边已存在的单链置换下来，通过单链延伸和链置换，产生的信号分子DNA单链越来越多；

步骤一五：以步骤一四中产生的信号分子DNA单链作为信号输入，互补结合于信号扩增序列模板中的第二信号分子互补序列，在DNA聚合酶的作用下进一步延伸为双链；

步骤一六：切刻内切酶识别信号扩增序列模板中双链状态的第二切刻酶识别序列，并切刻DNA链，产生一个切刻缺口；

步骤一七：切刻内切酶产生的切口，在DNA聚合酶的作用下，切口右边的3＇端单链继续延长，同时切口左边已存在的单链置换下来；

步骤一八：被置换下来的信号分子DNA单链继续与信号扩增序列模板中的第二信号分子互补序列杂交，循环往复，指数倍扩增信号。