[发明专利]单管型多重微生物检测体系及其即时检测方法

说明书

本发明涉及一种单管型多重微生物检测体系及其即时检测方法，所述单管型多重微生物检测体系包括至少1种信号转换序列模板、1种信号扩增序列模板、DNA聚合酶、切刻内切酶、缓冲溶液、DNA解旋酶和/或随机六引物以及指示剂。本发明通过DNA解旋酶和/或随机六引物将待检测的标本中的病原微生物(DNA或RNA)转换成单链DNA，使单链DNA与信号转换序列模板互补结合，在切刻内切酶及DNA聚合酶的作用下生成信号分子DNA单链，信号分子DNA单链在信号扩增序列模板、切刻内切酶及DNA聚合酶的作用下不断扩增信号，通过指示剂的作用表征检测体系的颜色变化，即可检测出是否具备病原微生物，通过进一步的筛查即可检测出待检测标本对应的病原微生物的种类。

技术领域

本发明涉及病源微生物检测技术领域，尤其涉及一种单管型多重微生物检测体系及其即时检测方法。

背景技术

当前病原微生物的检测都是基于病原微生物的抗原、抗体或的核酸物质，专业的检测机构如医院和第三方诊断机构，因为拥有专业的人员和各类设备仪器，可以优先追求结果的可靠准确，可以接受复杂的操作流程；但是在缺乏条件的地方如诊所、家庭和野外作业时，因为缺乏复杂昂贵仪器，就需要操作极简单，方便判读的方法。

之前人们也开发了一些即时检测方法，如利用体液中病原微生物的抗原或者抗体，做的胶体金免疫层析试纸，属于成熟的即时检测方法。可针对公共卫生危害比较大的病原微生物做出即时检测，如HIV检测试纸，此类层析试纸基于抗原抗体的方法，决定了其方法的敏感性不足，一般高危行为发生2周后方可检测艾滋病病毒抗体；适用于有明确怀疑病原微生物对象的场景，如高危行为后排查HIV感染情况；然而日常中最多见的场景是呼吸道系统或泌尿系统等细菌和病毒感染；呼吸道系统或泌尿系统等病原微生物种类繁多，目前并没有针对此类情况开发的层析试纸，个人家庭也不太可能每种试纸都购买和测试，因此不适用于呼吸道或泌尿系统感染等未有明确可怀疑病原微生物的大范围筛查。

环介导等温扩增技术(Loop-mediated isothermal amplification，LAMP)是一种等温特异扩增病原微生物核酸的技术，也是成熟的即时检测方法；优点是特异性高，60℃恒温扩增，产生的信号强；然而此类方法也是检测单一病原微生物的核酸，不能做到多重，适合于针对公共卫生危害比较大的病原微生物，同样不适宜用于常见呼吸道或泌尿系统感染等未有明确怀疑对象的病原微生物的大范围筛查。

血液中的游离DNA中包含了来自周身各种组织细胞的基因组，理论上也会包含各类病毒和微生物的基因组。有人之前已经注意到，游离DNA的高通量测序数据中，会有1％左右的序列不能匹配到人类基因组。斯坦福大学Stephen R.Quake团队分析了1351例样本的cf-DNA测序数据，提取其中的非人源序列，组装后发现其中只有很少一部分能匹配上已知的细菌基因组，大多数未鉴定序列可能来自未知微生物。特别在病原体如细菌或病毒感染的情况下，其释放到血液中的基因组DNA或RNA大大增加。本专利在于开发一种单管即时检测多种病原微生物的方法。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明提供一种单管型多重微生物检测体系及其即时检测方法，实现多种病原微生物的即时检测。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：所述单管型多重微生物检测体系包括至少种信号转换序列模板、1种信号扩增序列模板、DNA聚合酶、切刻内切酶、缓冲溶液、DNA解旋酶和/或随机六引物以及指示剂。

在本发明提供的单管型多重微生物检测体系的一种较佳实施例中，所述信号转换序列模板和信号扩增序列模板为DNA单链核酸，且所述信号转换序列模板和信号扩增序列模板的3＇末端具有化学修饰。

在本发明提供的单管型多重微生物检测体系的一种较佳实施例中，所述化学修饰包括修饰2个颠倒的胸腺嘧啶idT。

在本发明提供的单管型多重微生物检测体系的一种较佳实施例中，每一所述信号转换序列模板由3段序列组成，从5＇到3＇依次为信号分子序列、第一切刻酶识别序列和病原微生物识别序列。