[发明专利]一种新型核酸探针标记方法

说明书

本发明提供了一种DNA荧光探针的标记方法，包括：荧光探针5’端标记一个荧光基团、3’端标记一个淬灭基团外，探针序列中间标记另一个与5’相同的荧光基团。通过使用该标记方法获得荧光强度不同于普通标记、但发射波长相同的新探针，在PCR中增加单一通道的检测目标基因数。

技术领域

本发明涉及检测基因的新型探针和检测方法，特别涉及新型探针与普通探针在同一通道检测时的差别。

背景技术

微滴数字PCR平台(Droplet digital PCR，ddPCR)是基于PCR技术的第三代检测方法，采用一种全新的方式对核酸分子进行绝对定量，与传统PCR、定量PCR相比，具有更高的精确度、准确度和灵敏性。ddPCR定量的结果不再依赖于Ct值，实现真正意义上的绝对定量。除应由上的巨大优势外，ddPCR有一定限制。由于检测过程使用双通道，ddPCR理论上每次可检测两个目标基因。

对肿瘤患者临床检测的金标准是使用从肿瘤组织中抽提的DNA进行检测。鉴于部分病人肿瘤组织很难获得，比如乳腺癌病人发现较晚不适合进行手术切除或组织活检，以及在治疗过程中需要多次取样进行病程监控，血液中的循环肿瘤DNA(circulating tumorDNA,ctDNA)是进行临床检测的重要样本来源。由于ctDNA在血液中含量极低，进行ddPCR检测受到很大限制。

另一方面，对于临床研究而言，病人样本极其珍贵，获得来源受限，同时病人样本的获取量必须符合相关规定，不足以满足目前大量科学研究的需要。因此，使用尽可能少的样本获得精确的检测结果，是很多科研项目能够顺利开展的前提。

因此，需要一种新型探针，可以快速、精确地检测多个目的基因拷贝数，并与普通探针能够区分。本发明的新型探针及其检测方法解决了该问题。

发明内容

在本发明的一方面，提供了一种新型探针标记方法，包括：

a)荧光探针5’端标记一个常规荧光基团、3’端标记一个相对应的淬灭基团；

b)在DNA探针序列前1/3到后1/3的中间序列，标记一个与5’端相同的荧光基团；和

c)说明书，所述说明书提供了PCR检测中每个单通道检测两个目的基因的方法，其中通过对样本进行PCR扩增，将所述新探针的检测信号和常规探针检测信号进行区分，计算目的基因拷贝数。

在本发明的一个实施例中，所述的新型探针检测还包括至少一种选自下组的试剂：

a)DNA聚合酶；

b)核苷酸单体混合物；和

c)能够扩增含有所述目的基因序列的一对引物或两对引物。

在本发明的一个实施例中，所述的新型探针能用于检测多个目的靶点的拷贝数。

在本发明的一个具体实施例中，目的靶点可能为同一基因的突变型位点和野生型位点，也可能为不同基因的不同位点。

在本发明的一个具体实施例中，所述PCR为数字PCR。

在本发明的一个实施例中，如权利要求1所述的新探针，其中，第2个荧光基团标记范围为DNA探针序列前1/3到后1/3的中间序列。

在本发明的一个实施例中，探针长度包括50bp以下、40bp以下、30bp以下、20bp以下，或10bp以下。