[发明专利]一种卵巢组织程序化冷冻保存的方法

权利要求书

1.按照本发明提供的技术方案，一种以PROH作为冷冻保护剂的主要成份，以及采用该抗冻剂的程序化降温方案，用于哺乳动物卵巢组织冷冻的方法，其特征性步骤如下：

1.卵巢组织冷冻液、解冻液和培养液的配制

卵巢组织冷冻、解冻所用的溶液都是在冻融基础液里添加不同种类不同浓度的冷冻保护剂配制而成。所有溶液均经过0.22μm孔径过滤器过滤除菌。

1.1 冻融基础液：即含5mg/ml人血清白蛋白(human serum albumin,HSA)的HEPES缓冲的人输卵管液(human tubal fluid,HTF)：在95ml HEPES-HTF培养液中加入5ml HSA。

1.2 解冻复苏液：在10ml冻融基础液中加入3.4g蔗糖，蔗糖终浓度1M。

1.3 第一冷冻保护液：在890μl冻融基础液中加入110μl的PROH，PROH终浓度为1.5M。

1.4 第二冷冻保护液：在790μl冻融基础液中加入110μl的PROH和100μl的解冻复苏液，PROH终浓度为1.5M。

1.5 第一复苏液：冻融基础液：解冻复苏液(v/v)＝2：1(蔗糖0.28M)

1.6 第二复苏液：冻融基础液：解冻复苏液(v/v)＝4：1(蔗糖0.17M)

2.卵巢组织的冷冻、解冻过程

2.1 室温下(22℃～25℃)将卵巢组织转移到第一冷冻保护液中浸泡5分钟，接着把组织条移到装有1ml第二冷冻保护液的1.8ml冷冻管中4℃平衡30分钟，转到程序化冷冻仪进行程序化冷冻。

2.2 程序冷冻仪运行程序如下：

2.2.1 自4℃开始，-2℃/min降到-8℃；

2.2.2 在-8℃维持10分钟；然后用预先在液氮中预冷的镊子进行手工植冰；再在-8℃维持10分钟；

2.2.3 以-0.3℃/min速度降温到-40℃；

2.2.4 以-30℃/min速度降温到-150℃；

2.2.5 迅速投入液氮中保存。

2.3 冷冻48h后，进行复苏。将冷冻管从液氮中取出，空气中静置10秒。后将冷冻管置于37℃水浴中并不断晃动，2-3分钟肉眼可见冰晶完全融解，取出卵巢组织。依次在第一复苏液、第二复苏液中逐步重吸水，每次平衡时间5分钟，最后在冻融基础液中漂洗若干次，置37℃、5％CO₂、湿润培养箱中待后续处理。