[发明专利]一种卵巢组织程序化冷冻保存的方法

说明书

本发明涉及用于哺乳动物卵巢组织程序化冷冻保存的技术体系属于组织冷冻保存技术领域。经该发明冷冻‑复苏后的卵巢组织能够保持良好的生理活性。卵巢组织冷冻不仅可以保存卵巢生成配子的功能，还能保持其内分泌功能，在生育力保存方面有着无法比拟的优势。本发明在获得和处理卵巢组织后，经过冷冻保护剂平衡、程序化冷冻仪降温，将卵巢组织保存于液氮之中。通过改良冷冻保护剂成分和配比、平衡时间以及冷冻降温程序，本发明能够很好的保护卵巢组织中的卵泡，免受冷冻‑复苏刺激的破坏，为哺乳动物生育力保护和保存提供了一种可行性的方法。

技术领域

本发明涉及用于哺乳动物卵巢组织程序化冷冻保存的技术体系，可使哺乳动物卵巢组织经过冷冻-复苏后保持良好的生理活性，属于组织冷冻保存技术领域。

背景技术

卵巢组织冷冻在保存卵巢功能方面有其独特的优势。首先，卵巢皮质含有大量的原始生殖细胞，位于距卵巢表面1mm的皮质区，这部分卵泡是卵巢组织冷冻的主要保护对象。其次，卵巢组织中的原始卵泡体积较小，处于很低的代谢状态，对低温敏感的胞内脂质含量甚低，所以原始卵泡比成熟卵泡更能耐受低温冷冻过程。第三，人卵巢皮质可以通过腹腔镜或者开腹手术获得，既不受月经周期的影响，也不会推迟肿瘤治疗的时间。第四，卵巢皮质冷冻不仅可以保存患者的生育能力，还可以保存其内分泌功能。第五，卵巢组织冷冻可用于保存青春期前女孩的生育功能。卵巢组织冷冻保存因具有上述无可替代的优势。

然而，卵巢组织冷冻比配子或胚胎冷冻复杂得多，因为它要求保存的是具有一定体积且含有多种细胞类型的组织体系。所以卵巢组织冷冻更接近于器官冷冻而非配子冷冻。卵巢皮质内的大部分卵泡为处于静止状态的原始卵泡，由单层扁平的前颗粒细胞环绕，其中含有一个初级卵母细胞，体积仅为成熟卵子的1/10。与生长卵泡比较，原始卵泡体积小，允许冷冻保护液迅速穿透，进入内部的卵母细胞，而且原始卵泡代谢缓慢，支持细胞数少，因而更能耐受冷冻所造成的毒性。此外，虽然在技术上可以分离原始卵泡，但是其周围的组织对于卵泡的进一步成熟发育有着重要影响，目前保存原始卵泡的唯一实际的方法就是将其保存在皮质中。

卵巢组织程序化冷冻主要采用低浓度冷冻保护剂对卵巢组织进行梯度脱水，经程序化冷冻仪缓慢降温。慢速冷冻技术已经在许多研究领域得到广泛应用，在辅助生殖方面早已广泛应用于胚胎冷冻和胚子的冷冻，在卵巢组织冷冻方面，包括人类在内的许多物种都取得了令人惊喜的成绩。目前，全球范围内通过卵巢组织冻存技术，已顺利分娩了超过130个健康婴儿，并且通过自体移植技术，不仅保存了患者的生育能力，也重建了生殖分泌功能。尽管程序化冷冻目前已经取得了很好的成绩，但是程序化冷冻方案的优化存在许多难题。因为卵巢组织中含有许多种类的细胞，如间质细胞，卵母细胞，颗粒细胞和卵泡膜细胞，而且还有许多血管、神经贯穿其中，这些结构对于卵巢组织移植后功能的恢复有着密切的联系。而一些可以影响冻融后组织生存能力的因素，如对冷冻保护剂的渗透性，毒性的耐受，液压传导率等，在不同细胞之间是不同的，所以卵巢组织复杂成分对于冷冻保护剂的浓度以及降温要求也不尽相同，卵巢组织冷冻方案需要在不同类型细胞的最佳脱水时间、降温和复温速度之间达成妥协。

发明内容

本发明的目的在于，提供一种哺乳动物卵巢组织低损伤冷冻保存的抗冻剂，以及采用该抗冻剂用于哺乳动物卵巢组织冷冻的程序化降温方案，本发明以丙二醇(propanediol，PROH)作为冷冻保护剂的主要成份，将卵巢皮质冷冻后在液氮中保存48小时后快速复苏。以新鲜卵巢组织为对照，常规HE染色观察各组卵泡形态，计数形态正常和异常的原始和初级卵泡，计算各组卵巢组织的原始和初级卵泡形态正常率。评价PROH冷冻保护剂配伍与冷冻-解冻技术体系，以保持哺乳动物卵巢组织在冷冻-解冻后的生理活性。

按照本发明提供的技术方案，一种以PROH作为冷冻保护剂的主要成份，以及采用该抗冻剂的程序化降温方案，用于哺乳动物卵巢组织冷冻的方法，其特征性步骤如下：

1.卵巢组织冷冻液、解冻液和培养液的配制