[发明专利]一种用于修复污染水体的转基因植物质粒p3301-121-ZnT1及应用

权利要求书

1.一种用于修复污染水体的转基因植物质粒p3301-121-ZnT1。

2.一种采用转基因植物质粒p3301-121-ZnT1对污染水体进行修复的方法，其特征在于按如下的步骤进行：

（1）构建植物表达载体

a.根据NCBI数据库查询Znt1序列，由南京一道生物科技有限公司化学合成Znt1基因片段，将含有表达载体p3301-121-Znt1的大肠杆菌液划线培养至含卡那霉素（Kan）的LB（Luria-Bertani）培养基中，37℃下过夜培养至OD₆₀₀=0.4-0.6；

b.使用柱式质粒DNA小量抽提试剂盒法提取大肠杆菌液中的扩繁载体，收集过夜培养的目标大肠杆菌菌液（DH5α），对目标菌体进行重悬、裂解、中和操作之后，向吸附柱中央加入65℃的Elution Buffer，在13000rpm下离心1分钟后静置，将收集的目标载体存于-40℃冰箱；

c.将含有目的基因的植物表达载体p3301-121-Znt1导入农杆菌EHA105中，获得用于植物遗传转化的工程菌；首先制备感受态农杆菌，并保存于-80℃冰箱；将纯化后质粒DNA加入解冻后的农杆菌液，将混合物在2.5kV、25uF条件下进行脉冲电转化，重悬细胞震荡培养后涂布于含有卡那霉素（Kan）+利福平（Rif）的YEB培养基；

（2）、构建转基因植株

a.受体材料预培养：将无菌植物叶片剪为1cm×1cm的小块，茎段纵向切为1cm的切断，置于愈伤组织培养基上进行预培养2-3d，切口开始膨大时进行侵染；

b.农杆菌液预培养：平板上挑取单菌落接种至含有Kan+Rif的YEB液体培养液中，室温下180rpm震荡培养至OD₆₀₀=0.2-0.5后即可用于转化；

c.将菌液置于20ml无菌离心管中，6000rpm离心10分钟后弃上清液，向离心管中加入MS培养液，震荡至沉淀消失，无菌操作台上将预处理后的植物叶片及茎段加入MS重悬液，倒置数次后静置，共培养20分钟，侵染后的外植体植株移至MS固体培养基中培养2-3d后移至含有Kan+Rif的愈伤组织培养基中。

3.权利要求2所述的采用转基因植物质粒p3301-121-ZnT1对污染水体进行修复的方法，其特征在于所述的植物为：水花生，菖蒲，黄芹，浮萍。

4.权利要求2所述的采用转基因植物质粒p3301-121-ZnT1对污染水体进行修复的方法，其特征是YEB培养基是酵母提取物 6g/L、胰蛋白胨5g/L、葡萄糖5g/L、MgSO₄0.4938g/L、pH=7.2，固体培养基含琼脂15g。

5.权利要求2所述的采用转基因植物质粒p3301-121-ZnT1对污染水体进行修复的方法，其特征是愈伤组织培养基是MS+2,4D（2mg/L）+6BA（1mg/L）+Kan（50mg/L）+Rif（200mg/L）。

6.权利要求2所述采用转基因植物质粒p3301-121-ZnT1对污染废水进行修复方法在对废水重金属污染进行修复方面的应用，所述的重金属指的是：Zn，Cd，Mn。