[发明专利]一种用于修复污染水体的转基因植物质粒p3301-121-ZnT1及应用

说明书

本发明是一种转基因植物应用于修复被污染水体的技术。通过对已发表的与重金属耐受性相关的ZnT1基因序列的化学合成，获得目标质粒p3301‑121‑ZnT1，使用叶盘法将含有目标质粒的农杆菌转入水花生，提高植物对Zn，Cd，Mn的耐受力和积累量，筛选并培养出重金属元素高积累量的转基因植株。转基因水花生可对Zn，Cd，Mn等金属元素污染的废水进行修复。该技术可广泛应用于重金属污染土壤与水体的生物修复领域，具有很好的修复效果和广阔的应用前景。

技术领域

本发明涉及生物修复污染技术领域，特别是利用转基因植物对由多种重金属污染的水体的修复。具体地说是一种用于修复污染水体的转基因植物质粒p3301-121-ZnT1及应用。

背景技术

随着基因工程技术的发展，耐金属基因的分子机制的研究也在不断的深化。利用基因工程对重金属污染的土壤的修复，目前已有研究成果包括以下几类。

1、金属结合蛋白基因

（1）金属硫蛋白基因（metallothioneins，MTs）

金属硫蛋白（MT）是一个复杂的基因家族，常存在于真核生物体内，MT基因具有耐热性较好，构象坚固的特点。它是一类富含半胱氨酸，由60个氨基酸组成的低分子量多肽。金属元素Cu，Ag，Au，Zn，Cd等对MT合成具有很强的诱导作用，MT-mRNA在重金属作用下转录水平大大提高。同时MT可以通过络合毒性金属如Pb，As，Hg等，从而使毒性金属元素在植物体内积累。

现有MT转基因成果较多，主要包括将拟南芥MT4a基因通过农杆菌浸染法引入豆科植物并使其在转基因植物的根中过表达，从而使转基因植株获得重金属抗性（Pérez-Palacios et al., 2017）。将以酵母金属硫蛋白为主要原材料的HisCUP基因导入烟草并在含有卡那霉素的培养基上进行筛选，在mRNA和蛋白质水平上检验HisCUP基因的表达水平。（J. Fiser et al., 2015）。将小鼠metallothionein-I基因转入聚球藻中，使转基因聚球藻的抗Cd，Pb，Hg，Zn耐性得到提升，且生长速度增快。（Zeng, W. L et al., 2008）。

（2）植物络合素合成酶基因（phytochelatin synthase， PCS）

植物络合素（PC）是一类非核糖体合成的多肽。PC对重金属在植物体内的转运和富集起重要作用，同时PC可以与植物体内的毒性重金属络合成配体复合物，从而保证植物免受毒害。Cu、Hg、Ag、Cd、Ni、Au、Pb、Zn等多种金属元素都可诱导PC生成，其中最强的诱导剂是Cd。

克隆其同源基因如：AtPCS1(或CAD1)、TaPCS1、SpCS1，这些蛋白具有催化CSH合成PCs活性的作用。研究表明烟草在转入来源于拟南芥的AtPCS1基因后其重金属耐受性明显增加（Brunetti, P. et al., 2011）。

PCS的活性受到转录水平的诱导与金属离子对酶活性的激活作用两种作用的调控（在有些物种中PCS基因可以持续性表达）。以一些藻类，真菌，无脊椎动中的一些PCs为研究对象，以拟南芥AtPCS1酶做为模板，讨论了植物络合素对重金属离子的解毒作用（Rea P.A. 2012）。

2、金属氧化还原蛋白基因（Metal REDOX protein）

（1）有机汞裂解酶基因（merB）和汞离子还原酶基因（merA）