[发明专利]多环芳烃底物吸附内衬及筛选多环芳烃降解突变菌的方法

说明书

本发明提供一种多环芳烃底物吸附内衬，所述底物吸附内衬为中空圆柱形或者中空方柱形，其外径比96孔板小孔内径小0.5～1.0mm，壁厚为0.1～0.3mm，柱高为3～7mm，壁体设有多个圆形或椭圆形通孔；所述96孔板小孔内径为10.7±0.2mm或6.8±0.2mm，所述通孔的直径或长轴为0.5～1.0mm。本发明属于环保生物技术领域，提供的多环芳烃底物吸附内衬结构简单，实现了突变菌株的生长情况的原位批量检测；提供的筛选多环芳烃降解突变菌的方法，代替原有的三角瓶培养，无需将孔内培养液吸出再检测，在节省成本的同时大大提高了效率，实现了高通量的检测和筛选。

技术领域

本发明属于环保生物技术领域，尤其涉及一种多环芳烃底物吸附内衬及高通量筛选多环芳烃降解突变菌的方法。

背景技术

多环芳烃(Polycyclic Aromatic Hydrocarbons，PAHs)指分子中含有两个以上苯环的碳氢化合物，包括萘、蒽、菲、芘等上百种化合物。多环芳烃的污染日益严重，由于其具有显著的“三致”(致癌变、致突变、致畸)效应，如何快速、有效治理成为亟待解决的任务。生物降解作为一种环境友好型处理方法得到广泛关注，而降解菌种的筛选是生物降解法施行的必要基础。当前，从污染环境中筛选出的菌种已有大量报道。为提高这些野生菌种的降解效率，通过突变选育降解能力更强的突变菌株用于多环芳烃降解实践是一个主要方法。

传统的多环芳烃降解突变株选育方法一般包括以下几个步骤：首先通过物理化学诱变后，挑选涂布获得的单菌落。然后将每个单菌落接种到含有底物多环芳烃三角瓶中，检验细胞生长。传统的多环芳烃降解方法需要将多环芳烃溶解于有机溶剂中，喷于三角瓶底部，待有机溶剂挥发后再加培养基和接种，通过细胞生长情况可判断出诱变菌株的多环芳烃降解能力。传统的多环芳烃降解方法往往涉及几十甚至几百个三角瓶的操作，费时费力，成本高，易污染，效率低，不利于高通量检测，也无法实现原位检测。

开发多环芳烃降解突变株的高通量筛选方法意义重大。应用96孔板替代三角瓶可实现高通量的快速筛选，而96孔板也让利用酶标仪进行原位高通量检测成为可能。中国专利申请CN 109182183A公开了一种利用96孔板高通量筛选石油降解突变菌的方法，该方法使用液体石油作为底物，悬浮和分散的油滴会干扰细胞生长产生的吸光度变化，但无法通过OD值检测细胞生长情况，因此只能通过繁琐的取样-萃取-转移等步骤来检测底物的消耗来计算石油的降解。由于多环芳烃作为一种不溶于水的底物，若以晶体方式直接添加于96孔板中，会对酶标仪的光路透过性产生影响，干扰测定；若以溶解于其他有机溶剂的方式添加于96孔板中，一方面添加的有机溶剂可能会对细胞产生毒性，另一方面也可能作为潜在的碳源被细胞利用，影响菌种选育效果。

因此，提供一种高通量、易推广的多环芳烃降解突变菌的检测方法，对于多环芳烃降解菌突变菌种资源的开发和污染治理具有重要意义。

发明内容

为克服多环芳烃作为底物的添加方式对细胞生长原位检测的影响，本发明提供了一种用于96孔板的多环芳烃底物吸附内衬，该底物吸附内衬可通过底物升华法在表面均匀的吸附一层多环芳烃，置于96孔板的小孔中，将底物固定于小孔的侧壁附近，不遮挡小孔底部，也不会在培养过程中散落在培养液中，进而避免了对光路透过性的影响，通过96孔板培养可使用酶标仪在600nm波长下原位检测菌体生长的吸光度值，依此判断突变菌株的代谢能力。在提供多环芳烃底物吸附内衬的基础上，本发明还提供了底物吸附内衬的吸附方法，以及筛选多环芳烃降解突变菌的方法。本发明提供的多环芳烃底物吸附内衬及筛选多环芳烃降解突变菌的方法，成本低，操作简便，易于推广，大大提高了多环芳烃降解突变菌的筛选效率。

本发明的目的将通过下面的详细描述来进一步说明。

本发明提供一种多环芳烃底物吸附内衬，所述底物吸附内衬为中空圆柱形或者中空方柱形，其外径比96孔板小孔内径小0.5～1.0mm，壁厚为0.1～0.3mm，柱高为3～7mm，壁体设有多个圆形或椭圆形通孔；所述96孔板小孔内径为10.7±0.2mm或6.8±0.2mm，所述通孔的直径或长轴为0.5～1.0mm。