[发明专利]基于运动发酵单胞菌内源CRISPR-Cas系统的多基因位点同时编辑方法及其应用有效
| 申请号： | 201910692118.8 | 申请日： | 2019-07-30 |
| 公开（公告）号： | CN110331158B | 公开（公告）日： | 2021-09-14 |
| 发明（设计）人： | 彭文舫;杨世辉;郑艳丽;易犁;马立新 | 申请（专利权）人： | 湖北大学 |
| 主分类号： | C12N15/74 | 分类号： | C12N15/74;C12N1/21;C12R1/01 |
| 代理公司： | 北京金智普华知识产权代理有限公司 11401 | 代理人： | 杨采良 |
| 地址： | 430062 湖北*** | 国省代码： | 湖北;42 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 基于 运动 发酵 单胞菌 内源 crispr cas 系统 多基因 同时 编辑 方法 及其 应用 | ||
1.基于运动发酵单胞菌内源CRISPR-Cas系统的多基因位点同时编辑方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1：构建含人工CRISPR表达单元的质粒；
步骤2：选取3个目标编辑靶位点，针对目标编辑靶位点设计gRNA序列；选取目标基因3’末端截取5’-NCC-3’下游紧邻的32 bp序列作为gRNA；
步骤3：将3个所述gRNA序列串联，并构建至含人工CRISPR表达单元的质粒上，构建载体；
步骤4：将供体DNA序列构建至载体上，获得编辑质粒；
步骤5：将编辑质粒转化至运动发酵单胞菌ZM4感受态细胞中进行编辑。
2.根据权利要求1所述的基于运动发酵单胞菌内源CRISPR-Cas系统的多基因位点同时编辑方法，其特征在于：所述含人工CRISPR表达单元的质粒为在
3.根据权利要求2所述的基于运动发酵单胞菌内源CRISPR-Cas系统的多基因位点同时编辑方法，其特征在于：所述人工CRISPR表达单元包括启动子leader序列，CRISPR簇及终止子。
4.根据权利要求3所述的基于运动发酵单胞菌内源CRISPR-Cas系统的多基因位点同时编辑方法，其特征在于：所述人工CRISPR簇包括四个repeat。
5.根据权利要求1所述的基于运动发酵单胞菌内源CRISPR-Cas系统的多基因位点同时编辑方法，其特征在于：所述gRNA可位于基因组任一条链上。
6.根据权利要求1所述的基于运动发酵单胞菌内源CRISPR-Cas系统的多基因位点同时编辑方法，其特征在于：步骤4中，选取3个目标编辑靶位点上、下游序列作为供体DNA，并分别设计引物，通过融合PCR技术进行扩增和连接。
7.如权利要求1-6任一所述的基于运动发酵单胞菌内源CRISPR-Cas系统的多基因位点同时编辑方法在多基因组位点同时编辑中的应用。
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