[发明专利]基于运动发酵单胞菌内源CRISPR-Cas系统的多基因位点同时编辑方法及其应用

说明书

本发明属于基因工程技术领域，尤其涉及基于运动发酵单胞菌内源CRISPR‑Cas系统的多基因位点同时编辑方法及其应用。该方法主要包括以下步骤：构建含人工CRISPR表达单元的质粒；选取若干个目标编辑靶位点，设计gRNA序列；将若干个gRNA序列串联，构建至含人工CRISPR表达单元的质粒上；将供体DNA序列构建至载体上，获得编辑质粒；将编辑质粒转化至感受态细胞中进行编辑。本发明利用运动发酵单胞菌内源CRISPR‑Cas系统构建基因编辑平台，打破外源CRISPR‑Cas9基因组编辑在该类菌株中效率低下的限制，在该菌株中实现多基因的同时快速、高效敲除，促进代谢工程、系统生物学及合成生物学的发展。

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，尤其涉及基于运动发酵单胞菌内源CRISPR-Cas系统的多基因位点同时编辑方法及其应用。

背景技术

近年来，利用微生物进行代谢工程、系统生物学及合成生物学等方面的研究取得了良好的进展，为理性化设计、构建微生物细胞工厂，利用生物体活细胞或酶对可再生生物质，如纤维素等进行物质转化，生产生物能源，实现生物冶炼的工业化提供了重要的理论基础。生物能源再生化是解决人类目前面临的资源、能源短缺及环境污染严重等问题的有效手段之一。

常规的遗传操作方法操作繁琐，周期长，难以满足微生物细胞工厂的构建要求。比如，快速、同时敲除多个基因/基因簇，需要高通量基因编辑技术的辅助，如基于CRISPR-Cas系统的基因编辑平台。然而，由于外源表达Cas9等核酸酶造成的细胞毒性，造成转化效率非常低，最终严重影响基因编辑；对于同时敲除多个基因更是无法实现。

常规的遗传学方法能实现对基因进行突变，但通常只能单个单个地完成，耗时较长，效率太低，无法满足诸如构建复杂的代谢通路等研究的要求。而且，对于每一个目标基因的突变，均需要引入特定的选择标记，会存在可用选择标记有限、引入抗生素标记而产生的生物安全隐患等等一些问题。此外，为了提高细胞体内DNA重组效率，可利用序列特异性核酸酶对目的基因进行定点剪切，促进基因组与供体DNA的重组，定点引入突变，实现基因组的精准编辑。例如，锌指核酸酶（Zinc finger nucleases，ZFNs）和转录激活样效应物核酸酶（Transcription activator-like effector nucleases，TALENs）被成功用于对基因组进行定点剪切。但是，对每一个靶标位点的剪切，均需要对上述蛋白进行一次改造，实验步骤较为复杂。相比于ZFN和TALEN技术，基于CRISPR-Cas系统的基因组编辑技术对不同目的DNA的靶定不需要进行蛋白改造，只需要简单改变单个介导RNA（gRNA）序列，易于操作。然而，由于目前常用的Cas9为具多个结构域的大核酸蛋白（大于1000氨基酸），存在难以转运到目的细胞内的潜在难度，更重要的是，随着研究的深入，越来越多的结果显示，异源表达这些核酸酶会对宿主产生不同程度的细胞毒性，对于原核细胞尤为突出。

Cas9对运动发酵单胞菌有较为明显的细胞毒性，在质粒上表达Cas9会造成转化效率上千倍降低，数据比较见图1。此外，要实现多个位点的同时编辑，需要将多个gRNA表达框进行成簇克隆和表达，操作工序繁杂，耗时长。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明提供了基于运动发酵单胞菌内源CRISPR-Cas系统的多基因位点同时编辑方法及其应用。

本发明是这样实现的，基于运动发酵单胞菌内源CRISPR-Cas系统的多基因位点同时编辑方法，包括以下步骤：

步骤1：构建含人工CRISPR表达单元的质粒；

步骤2：选取若干个目标编辑靶位点，针对目标编辑靶位点设计gRNA序列；

步骤3：将若干个所述gRNA序列串联，并构建至含人工CRISPR表达单元的质粒上，构建载体；

步骤4：将供体DNA序列构建至载体上，获得编辑质粒；

步骤5：将编辑质粒转化至感受态细胞中进行编辑。