[发明专利]一种提高去甲四环素产量的方法

说明书

本发明提供一种提高去甲四环素产量的方法。本发明通过对金霉素链霉菌(Streptomyces aureofaciens)进行基因工程改造，以提高工程菌发酵生产去甲四环素的产量。本发明中涉及的基因包括金霉素生物合成基因ctcK、ctcB，外排基因ctcR，抗性基因ctcC以及金霉素生物合成基因ctcK的下游基因。本发明采用不同策略不断提高替加环素等三代四环素合成前体去甲四环素的产量，为利用去甲四环素为原料药合成二代、三代四环素奠定了基础。

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体地说，涉及一种提高去甲四环素产量的方法。

背景技术

四环素类抗生素是效果最好的广谱抗生素，广泛用于抗感染的临床治疗。第一代四环素类抗生素，如四环素(tetracycline)、土霉素(oxytetracycline)、金霉素(chlortetracycline)等由于存在一定毒副作用，并在长期临床使用中出现了大量耐药菌，因此已逐步退出临床一线用药(Salyers et al.,1990；Taylor and Chau,1996)。然而对于高效广谱抗生素的迫切需求使得人们加强了对一代四环素的修饰改造，开发了米诺环素(minocycline)、强力霉素(doxicycline)等第二代四环抗生素和以替加环素(tigecycline)为代表的第三代四环类抗生素(Nelson and Levy,2011)。由于近年来耐药菌形式日益严峻，对于新的抗耐药菌的需求和投入进一步加大。2018年，美国FDA批准了奥玛环素(omadacycline)、sarecycline和依雷环素(eravacycline)三个新四环素(图1)。奥玛环素、sarecycline和替加环素同属于三代四环素，依雷环素属于四代全合成四环素。

实际生产中，对于新一代抗生素替加环素，多采用化学合成的方法生产，其过程是从去甲金霉素出发，经钯催化加氢脱氯合成去甲四环素，再进一步钯催化加氢脱羟基合成山环素，继而在7位引入二甲氨基修饰等修饰基团合成米诺环素，进一步化学修饰合成替加环素。在每一步催化过程中，都有收率损失和成本增加(Fuoco,2012)。如果减少从去甲金霉素到替加环素的步骤，采用去甲四环素作为出发原料药去合成山环素、进而合成米诺环素、替加环素，对于降低替加环素成本具有重要意义。另外，降低了奥玛环素、sarecycline和依雷环素的合成成本(图2)。

发明内容

本发明的目的是提供一种提高去甲四环素产量的方法，解决从去甲四环素出发合成二代、三代四环素的新路线的原料来源问题。

本发明的另一目的是提供一种高产去甲四环素的工程菌株的构建方法。

为了实现本发明目的，第一方面，本发明提供一种产去甲四环素工程菌的构建方法，所述方法包括弱化金霉素链霉菌(Streptomyces aureofaciens)中金霉素生物合成基因ctcK，获得基因弱化菌株作为产去甲四环素工程菌；所述弱化包括敲除或降低基因的表达。

所述方法还包括增强金霉素链霉菌中金霉素生物合成基因ctcB，获得基因增强菌株作为产去甲四环素工程菌。

所述增强的途径选自以下1)～5)，或任选的组合：

1)通过导入具有所述基因的质粒而增强；

2)通过增加染色体上所述基因的拷贝数而增强；

3)通过改变染色体上所述基因的启动子序列而增强；

4)通过将强启动子与所述基因可操作地连接而增强；

5)通过使用具有编码高活性的相应酶或蛋白质的基因或等位基因而增强。

所述方法还包括增强金霉素链霉菌中外排基因ctcR和/或抗性基因ctcC，获得基因增强菌株作为产去甲四环素工程菌。