[发明专利]一种建库方法及应用

说明书

本发明公开了一种建库方法及应用。本发明提供了一种用于检测待测样本目的基因待检区域的变异情况的扩增子文库构建方法，包括如下步骤：1)根据目标区域设计合成上游外引物F1、上游内引物F2和下游引物R；2)用所述上游外引物F1、所述上游内引物F2和所述下游内引物R对待测样本进行一步PCR扩增，得到扩增产物，即为目标区域的扩增子文库。该一步法建库技术可以应用于包括IonTorrent、illumina和BGI/MGI在内的所有二代平台，以此建库方法为基础，本发明开发出了针对DNA的SNP、Ins/Del、CNV、甲基化的检测，以及针对RNA样本的基因融合和表达的检测产品。

技术领域

本发明涉及分子生物学技术领域，具体涉及一种建库方法及应用。

背景技术

一般来说，现阶段对目标区域序列进行测序分析，需要首先进行文库构建，而文库构建的方式总的来说不外乎捕获建库和扩增建库。

捕获建库相对来说是进行基因组较大区域，如几十、数百个基因全外显子区域的富集建库，而多重扩增建库是进行特定热点区域，或者个别基因的全外显子区域的靶 向捕获并测序分析。

扩增建库方法，就是根据目标区域设计相应的特异性引物，之后使用这些引物对靶向序列进行多重扩增，需要注意的是，这些特异性引物会直接带有测序接头或者带 有搭桥序列，之后经过二次PCR扩增，为其添加测序接头，这就是一般扩增建库的流 程。现有的扩增建库方式在应用时会存在一些问题，如建库流程较为繁琐，需要至少 两轮PCR扩增以及两次对应的文库纯化，手动操作时间较多，对建库人员要求高，不 利于推广；引物设计、体系优化较为复杂；建库成本较高；整个建库流程所需的时间 较长等弊端。

发明内容

针对扩增建库方式存在的各种问题，本发明提供了如下技术方案。

本发明一个目的是提供一种用于检测目的基因变异情况的扩增子文库构建的引物 组合。

本发明提供的引物组合，包括：

根据目标扩增子设计的上游外引物F1、上游内引物F2和下游引物R；

所述上游外引物F1依次由测序接头序列1、用于区分不同样本的barcode序列和通用序列组成；

所述上游内引物F2依次由通用序列和所述目标扩增子的上游特异性引物序列组成；

所述下游外引物R依次由测序接头2和所述目标扩增子的下游特异性引物序列组成。

上述引物组合中，可选的，所述上游内引物F2依次由通用序列、分子标签序列和所述目标扩增子的上游特异性引物序列组成。

所述分子标签序列由6-30个碱基组成，包括随机碱基和0-N(N为≥0的整数) 组特定碱基；所述特定碱基设置于随机碱基中，设置例如，1组、2组、3组或4组； 所述每组特定碱基由1-5个碱基组成，例如1个、2个、3个、4个或5个。

所述每组的碱基序列随意选择，所述分子标签序列用于区分不同的起始DNA模 板分子，在一次文库构建过程中，所述分子标签序列中除特定碱基的位置和组成固定 外，随机碱基的碱基类别(A、T、G、C)随意选择。

例如，在本发明的一个实施例中，所述特定碱基设置为一组或两组，序列为ACT和/或TGA；例如，在本实施例中，所述分子标签序列为NNNNNACTNNNNTGA， 其中ACT和TGA为特定碱基，N为随机碱基，N为A、T、C或G。

上述引物组合中，所述测序接头1和所述测序接头2为根据不同测序平台选择对应的测序接头。

上述引物组合中，

所述测序平台为Illumina平台，所述测序接头1为I5，所述测序接头2为I7；