[发明专利]过表达木糖转运蛋白基因提高1,2,4-丁三醇产量的方法及应用

说明书

本发明公开了过表达木糖转运蛋白基因提高1,2,4‑丁三醇产量的方法及应用，属于基因工程技术领域。本发明应用基因工程方法，将带有E.coli W3110中xylE、xylFGH、araE基因的质粒转入到E.coli KXW3009中，从而提高其对木糖的转运能力，提高E.coli KXW3009中1,2,4‑丁三醇的产量。重组菌经48h摇瓶发酵，1,2,4‑丁三醇产量高达12.32g/L。此发明成功提高了工程菌E.coli KXW3009对木糖的转运能力，为选育1,2,4‑丁三醇高产菌株提供了崭新的思路。

技术领域

本发明涉及过表达木糖转运蛋白基因提高1,2,4-丁三醇产量的方法及应用，属于基因工程技术领域。

背景技术

1,2,4-丁三醇(1,2,4-butanetriol，BT)是一种非天然、高价值的四碳化合物，其性质与甘油相似，是一种无色、无臭、透明的糖浆状液体，易溶于水和醇类物质，具有一定的稳定性与吸湿性，常用作溶剂、润湿剂、医药和炸药的中间体。目前，在军事上使用的固体推进剂、塑化剂正逐渐由传统的硝化甘油(NG)向高能材料1,2,4-丁三醇三硝酸酯(1,2,4-butanetriol trinitrate,BTTN)过度，该化合物即是以BT为前体硝化后产生的，具有热稳定性强，冲击感小，不易挥发，加工安全等优点，为美国海军能源部使用。在医药领域，BT可作为缓释剂，以及合成治疗胆固醇药物与艾滋病药物及抗癌药物的重要中间体。除此之外，1,2,4-丁三醇还可以作为抑菌剂、卷烟添加剂、高分子材料的交联剂、服装表面处理剂等。

1,2,4-丁三醇的生产曾尝试用木质纤维素水解液作为底物，但其中含有的葡萄糖抑制木糖的转运。目前，生产BT利用的是化学合成法，但是化学合成BT存在反应条件苛刻、环境污染严重等缺点。因此，反应条件温和、对环境友好的生物法得到了广泛关注。BT是一种非天然化合物，自然界中不存在任何一种生物可以天然合成BT，因此BT的合成是通过人工构建合成途径来完成。2003年，由Frost团队提出的以大肠杆菌为宿主菌，由木糖变成木糖酸再经过脱水、脱羧、醇脱氢四步反应得到BT(引用自文献：Niu W,Molefe,Mapitso N,Frost,J.W.Microbial Synthesis of the Energetic Material Precursor 1,2,4-Butanetriol[J].Journal of the American Chemical Society,2003,125(43):12998-9.)。而在宿主大肠杆菌中，缺乏木糖脱氢酶和催化脱羧反应的酶，目前的研究主要集中在两个酶的筛选上，另外，研究发现，大肠杆菌利用木糖大部分用于生长，为降低成本，提高BT产量，所以添加葡萄糖用于菌株生长，采用葡萄糖和木糖共底物发酵。但是大肠杆菌对碳源的利用存在分级制度，因此当葡萄糖存在时，会被菌株优先利用，从而影响菌株对木糖的利用。然而，在葡萄糖和木糖共底物发酵研究中发现木糖总是会有很多剩余，同时有木糖酸的积累。因此，提供一种提高木糖转运率、降低副产物积累的方法，对1,2,4-丁三醇的工业生产有重要的应用价值。

发明内容

本发明的第一个目的是提供一种重组大肠杆菌，是在大肠杆菌中转入带有木糖转运蛋白基因xylE、xylFGH或araE的质粒，所述xylE编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述xylFGH编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示，所述araE编码的氨基酸序列如SEQ IDNO.6所示。

所述重组大肠杆菌以E.coli KXW3009为宿主。

所述E.coli KXW3009的具体构建方法见“景培源.多策略强化1,2,4-丁三醇的生物合成[D].江南大学,2018”。

所述重组大肠杆菌以pCDFDuet-ara为表达载体。

所述pCDFDuet-ara是将质粒pCDFDuet-1与阿拉伯糖启动子araBAD分别用限制性内切酶XbaI和EcoRI双酶切，随后将纯化后的阿拉伯糖启动子基因与pCDFDuet-1连接构建出pCDFDuet-ara载体。