[发明专利]一种用于鉴定牛瑟氏泰勒焦虫的引物组合及其应用

说明书

本发明公开了一种用于鉴定牛瑟氏泰勒焦虫的引物组合，属于分子生物学领域。该引物组合包括具有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的上游引物和具有SEQ ID NO.2所示核苷酸序列的下游引物。本发明还公开了包含该引物组合的试剂盒和相应的鉴定牛瑟氏泰勒焦虫的方法。本发明利用主要表面蛋白（MPSP）基因设计引物，为瑟氏泰勒焦虫的鉴定提供了一种全新的选择，扩增得到的序列与NCBI数据库中瑟氏泰勒焦虫序列的同源性更高，可以进行针对性地治疗，更加高效地防治泰勒焦虫感染。

技术领域

本发明属于分子生物学领域，具体地，涉及一种用于鉴定牛瑟氏泰勒焦虫的引物组合及其应用。

背景技术

牛泰勒虫病是由泰勒科(Theileriidae)泰勒属(Theileria)的原虫所引起的一种血液原虫病，泰勒虫主要侵袭牛的淋巴细胞和红细胞，患病的牛表现高热、贫血、黄疸、体表淋巴结肿大等临床症状，严重时可导致牛的死亡，对养牛产业带来损失。中国目前报道感染牛的泰勒虫共有三种，环形泰勒虫、中华泰勒虫和瑟氏泰勒虫，其中环形泰勒虫致病性最强，而瑟氏泰勒虫分布最广。牛的瑟氏泰勒虫病最早在韩国、日本出现，后来在中国也发现该病原，感染牛临床症状较环形泰勒虫感染轻，患牛表现精神不振、发热、贫血和淋巴结肿胀。

目前对于泰勒焦虫的研究主要集中在环形泰勒焦虫的研究上，在泰勒焦虫的鉴定方面，除了分子生物学方法以外还有间接ELISA方法的建立和研究，有些流行病学调查研究一般只鉴定到泰勒焦虫属，因此国内对瑟氏泰勒焦虫的分子生物学研究较少。

发明内容

为了解决上述技术问题，发明人根据NCBI数据库中的瑟氏泰勒焦虫MF996372.1序列主要表面蛋白(MPSP)基因设计了引物，出乎意料地发现，扩增后测得的序列经过NCBI数据库BLAST比对后显示与瑟氏泰勒焦虫的同源性达到99％，可以准确和快速的鉴定牛瑟氏泰勒焦虫，从而完成本发明。

本发明第一方面提供一种用于鉴定牛瑟氏泰勒焦虫的引物组合，包括具有SEQ IDNO.1所示核苷酸序列的上游引物和具有SEQ ID NO.2所示核苷酸序列的下游引物。

在本发明中，所述引物组合用于扩增MPSP基因，该基因编码的蛋白是泰勒属的保守蛋白。

本发明的第二方面提供本发明第一方面所述的引物组合在制备用于鉴定牛瑟氏泰勒焦虫的试剂盒中的应用。

本发明的第三方面提供一种用于鉴定牛瑟氏泰勒焦虫的试剂盒，包括本发明第一方面所述的引物组合。

在本发明的一些优选实施方案中，所述试剂盒还包括DNA聚合酶、dNTPs、缓冲液。

在本发明的另一些优选实施方案中，所述试剂盒还包括阳性对照样本。

在本发明的一些更优选实施方案中，所述阳性对照样本为已知牛瑟氏泰勒焦虫的MPSP基因序列。

在本发明的一些具体实施方案中，所述已知牛瑟氏泰勒焦虫的MPSP基因序列具有SEQ ID NO.3所示核苷酸序列。

本发明的第四方面提供一种鉴定牛瑟氏泰勒焦虫的方法，包括以下步骤：

(1)获得样本；

(2)提取所述样本的DNA样本；

(3)利用权利要求1所述的引物组合对步骤(2)所述DNA样本进行PCR扩增；

(4)利用凝胶电泳检测步骤(3)PCR扩增得到的PCR产物，

如果PCR产物检测到目标条带，则判定所述样本牛瑟氏泰勒焦虫阳性。

进一步地，所述目标条带大小约492bp。