[发明专利]一种原代肝细胞冻存液、肝细胞冻存的方法及肝细胞复苏的方法

权利要求书

1.一种原代肝细胞冻存液，其特征在于，由如下体积百分数的组分组成：45%的溶液A、45%的胎牛血清和10%的二甲基亚砜，其中，所述溶液A由如下组分组成：120mg/mL的D-葡萄糖、111mg/mL羟乙基淀粉、79.6mg/mL乳糖酸、51mg/mL聚乙烯吡咯烷酮、39.6mg/mL五水D-棉子糖、12.5mg/mL氢氧化钾、7.56mg/mL磷酸二氢钾、2.73mg/mL七水硫酸镁、2.98mg/mL腺苷、2mg/mL还原性谷胱甘肽、0.3mg/mL别嘌醇、6×10^-3mg/mL牛磺熊去氧胆酸和1mg/mL甘草酸二氨，调pH值至7.4,4℃保存。

2.一种肝细胞冻存的方法，其特征在于，包括：向经过常规处理后的肝细胞中加入权利要求1所述的原代肝细胞冻存液，混匀后冻存。

3.根据权利要求2所述的肝细胞冻存的方法，其特征在于，向经过常规处理后的肝细胞中加入冰浴的权利要求1所述的原代肝细胞冻存液，至冻存液中的细胞浓度为0.1×10⁷个活细胞/mL-1×10⁷个活细胞/mL,充分混匀，分装到冻存管中,放于程序降温盒中并于-80℃放置至少3h，最后转移到液氮中长期保存。

4.根据权利要求2或3所述的肝细胞冻存的方法，其特征在于，所述常规处理后的肝细胞由如下方法制备得到：

步骤1：两步胶原酶灌注法分离原代肝细胞

取新鲜的肝组织，用灌注溶液I灌注10min-30min，直至冲洗干净肝组织中的血液，然后再用37℃预热的灌注溶液II灌注15min-30min，直至肝组织失去弹性，得到消化好的肝组织；

步骤2：消化终止与细胞分散

将步骤1得到的消化好的肝组织转移到含有常温灌注溶液II的培养皿中，小心抖落消化好的细胞，形成细胞悬液并过细胞筛，得到单细胞悬液并离心；

步骤3：细胞洗液清洗

将步骤2得到的离心后的上清去掉，加入预冷的细胞洗液，巴氏吸管重悬细胞，再离心，重复本步骤2次，得到清洗好的单细胞悬液；

步骤4：细胞活力的检测

取步骤3得到的清洗好的单细胞悬液与0.4% m/v台盼蓝染色液以体积比1:1混匀，然后检测细胞活力，将细胞活力大于80%的单细胞悬液离心，去掉上清，即得到常规处理后的肝细胞。

5.根据权利要求4所述的肝细胞冻存的方法，其特征在于，步骤1中，所述灌注溶液I是由8.00g/L氯化钠、0.40g/L氯化钾、3.57g/L羟乙基哌嗪乙磺酸、0.06g/L二水磷酸氢二钠 、0.06g/L磷酸二氢钾、1g/L葡萄糖、1mM丙酮酸纳和2mM乙二醇双（2-氨基乙醚）四乙酸组成，pH值为7.4，用0.22μm微孔滤器过滤除菌，4℃保存所得；所述灌注溶液II是在威廉姆斯E培养基中添加2mM氯化钙、15mM 4-羟乙基哌嗪乙磺酸和0.3g/L Ⅳ型胶原酶，pH值为7.0-7.4，用0.22μm微孔滤器过滤除菌，现用现配，37℃水浴锅预热60min；步骤3中，所述细胞洗液是在DMEM/F12培养基中加入1%v/v青链霉素和5%v/v-10%v/v胎牛血清；步骤2、步骤3和步骤5中，所述离心的重力加速度均为50g，温度均为4℃，时间均为5min。

6.根据权利要求2或3所述的肝细胞冻存的方法，其特征在于，取冻存后的肝细胞，置于37℃水浴锅中迅速解冻，转移到生物安全柜中，以滴加方式加入到10倍体积的、37℃预热的复苏培养基中，颠倒混匀后，直接用于接种，或者再静置30min-45min，经过离心，去掉上清，加入复苏培养基或者等渗溶液进行重悬。

7.根据权利要求6所述的肝细胞冻存的方法，其特征在于，所述复苏培养基由1%v/v的ITS通用型培养添加剂、2mmol/L的L-谷氨酰胺、10μg/L的表皮生长因子、18mg/L的氢化可的松、40μg/L的地塞米松、1%v/v的青链霉素、10%v/v的胎牛血清和2%m/v-4%m/v的牛血清白蛋白组成；所述等渗溶液为生理盐水、磷酸盐缓冲液、威廉姆斯E培养基和DMEM培养基中的一种；所述离心的重力加速度为50g，温度为4℃，时间为5min。