[发明专利]一种原代肝细胞冻存液、肝细胞冻存的方法及肝细胞复苏的方法

说明书

本发明公开了一种原代肝细胞冻存液、肝细胞冻存的方法及肝细胞复苏的方法，属于原代肝细胞冻存与复苏领域。所述原代肝细胞冻存液，由如下体积百分数的组分组成：45％溶液A、10％‑45％胎牛血清、10％二甲基亚砜和0％‑35％水，所述溶液A由如下组分组成：D‑葡萄糖、羟乙基淀粉、乳糖酸、聚乙烯吡咯烷酮、五水D‑棉子糖、氢氧化钾、磷酸二氢钾、七水硫酸镁、腺苷、还原性谷胱甘肽、别嘌醇、牛磺熊去氧胆酸和甘草酸二氨。本发明还公开了一种肝细胞冻存的方法及肝细胞复苏的方法。本发明的原代肝细胞冻存液可以降低原代肝细胞在冻存过程中的损伤、提高解冻后原代肝细胞活力与贴壁效率，可广泛用于肝脏基础研究与新药研发过程中。

技术领域

本发明涉及一种原代肝细胞冻存液、肝细胞冻存的方法及肝细胞复苏的方法，属于肝细胞冻存与复苏技术领域。

背景技术

原代肝细胞是指从肝组织取出后立即培养的肝细胞，可广泛用于基础研究与药物研发，包括肝脏研究、肝炎病毒研究，药物代谢及毒性研究。然而，分离的原代肝细胞长期保存难、个体差异大、运输困难等局限性限制了其广泛应用。冻存可以在较大程度上解决长期保存难、个体差异大、运输困难等局限性。

目前，原代肝细胞冻存液及相应肝细胞的冻存与复苏方法有两种，具体如下：

第一种，传统的癌细胞冻存液，是在DMEM培养基中加入45％v/v的FBS和10％v/v的二甲基亚砜(DMSO)。冻存方法为程序降温盒于-80℃放置至少3h，最后转移到液氮中长期保存。复苏方法是置于37℃水浴锅中迅速解冻细胞，然后经过离心，去掉上清，利用铺板培养基重悬细胞即可。该冻存液在冻存癌细胞上具有优异的效果，但对原代肝细胞的冻存效果很差，存在细胞活力低、细胞难以贴壁的情况。因此，该冻存液及复苏方法并不适用于原代肝细胞的冻存与复苏。

第二种，CryoStorCS10冻存液，生产厂家为BioLifeSolutions，具体成分不详，因为生产厂家未公开，但价格昂贵，目前市场售价为3500人民币/100mL。冻存与复苏方法按该冻存液的说明书进行。采用该冻存液冻存的肝细胞，复苏后细胞活力高，但出现细胞不贴壁的几率非常大。因此，采用该冻存液冻存的肝细胞，仅可用于药物代谢研究。而药物毒性、药物诱导、肝脏基础研究等研究均需要用到贴壁的原代肝细胞。因此，该冻存液具有严重的局限性。

鉴于此，有必要提供一种新的、高效的原代肝细胞冻存液及利用其进行肝细胞冻存与复苏的方法，以解决现有技术的不足。

发明内容

本发明的目的之一，提供一种原代肝细胞冻存液。本发明的原代肝细胞冻存液，具有维持肝细胞正常渗透压、保护肝细胞膜、降低冻存与复苏对肝细胞活力与贴壁能力的影响等优点。相比于现有技术的癌细胞冻存液和CryoStorCS10冻存液，采用本发明的原代肝细胞冻存液可显著提升复苏后原代肝细胞的活力与贴壁能力。

本发明解决上述技术问题的技术方案如下：一种原代肝细胞冻存液，由如下体积百分数的组分组成：45％的溶液A、10％-45％的胎牛血清、10％的二甲基亚砜和0％-35％的水，其中，所述溶液A由如下组分组成：100mg/mL-140mg/mL的D-葡萄糖、90mg/mL-130mg/mL羟乙基淀粉、70mg/mL-90mg/mL乳糖酸、40mg/mL-60mg/mL聚乙烯吡咯烷酮、30mg/mL-50mg/mL五水D-棉子糖、10mg/mL-15mg/mL氢氧化钾、6mg/mL-9mg/mL磷酸二氢钾、2mg/mL-4mg/mL七水硫酸镁、2mg/mL-4mg/mL腺苷、1mg/mL-3mg/mL还原性谷胱甘肽、0.2mg/mL-0.4mg/mL别嘌醇、5×10^-3mg/mL-7×10^-3mg/mL牛磺熊去氧胆酸和1×10^-3mg/mL-10mg/mL甘草酸二氨，调pH值至7.4,4℃保存。

本发明的各个原料介绍：

1、D-葡萄糖