[发明专利]一种酶突变体

说明书

本发明公开了一种酶突变体，属于基因工程技术领域。此方法基于以SAPs为基础构建的功能性多肽文库，整个获得酶突变体的过程快速、高效、便捷；同时，本发明得到的酶突变体，相较于野生型碱性果胶酶，碱性果胶酶的融合酶突变体的胞外酶活最高提高了15.32倍，稳定性最高提高了3.86倍，比酶活最高提高了2.55倍；脂肪氧合酶融合酶突变体胞内酶活最高提高了2.49倍，稳定性最高提高了3.13倍，比酶活最高提高了0.9倍；天冬酰胺酶融合酶突变体胞外酶活最高提高了2.25倍，稳定性最高提高了3.56倍，比酶活最高提高了1.34倍。

技术领域

本发明涉及一种酶突变体，属于基因工程及酶工程技术领域。

背景技术

基于表达量及热稳定性对酶应用性能的重要影响，获得高表达量和高热稳定性的酶一直是酶工程领域的研究热点。

表达量，热稳定性及酶催化活力之间存在一定的相互促进关系，表达量方面，现有技术通常通过表达元件的优化或末端融合表达标签来提高蛋白酶的表达量，但是表达元件的优化具有一定的不确定性，并且最常用的表达标签MBP及GST等大分子，对酶的后期应用都具有一定的影响，往往需要繁琐的程序将其去除；稳定性方面，随着结构生物学与生物信息学的发展，研究者可以通过一些结构参数的分析(如B-因子、RMSF值等)或同源序列比对，较准确地定位影响酶分子热稳定性的氨基酸残基或肽段，进而对其进行定点突变提高酶的热稳定性。尽管已成为酶热稳定性改造的常规策略，上述分子改造技术仍有其固有的技术缺陷。定点突变的前提是获得准确的酶分子结构信息，体外定向进化则面临大量的突变体筛选，导致短时间内难以获得热稳定性明显提升的突变体。

因此，建立一种高效、便捷的酶稳定化策略成为国内外研究者关注的焦点。

值得注意的是，融合短肽对酶的表达量及热稳定性的提高是在无酶结构信息和大量突变体筛选的条件下完成的，较传统分子改造技术的效率显著提高。其最早是由日本大阪大学Urabe团队在研究嗜热脂肪芽孢杆菌过氧化氢酶的热稳定性时发现的(NatBiotechnol,1999,17(1):58-61)；研究者在过氧化氢酶C-端随机融合不同长度和氨基酸序列的短肽，得到一系列高热稳定性的突变体；此后，大阪大学Kanaya团队发现C-端融合嗜热古菌核糖核酸酶C-端七肽(IGCIILT)，可以不同程度地提高不同来源的核糖核酸酶的热稳定性(PLoS ONE,2011,6(1):e16226)。

SAPs是一类亲疏水氨基酸交替分布，能自发组装成纳米结构的短肽，其特有的两亲性质使得其在水中能形成水凝胶，从而对目的蛋白或其他小分子进行固定化。基于此，在本研究室前期研究中(Appl Microbiol Biot,2013,97(21):9419-9427)，将一类SAPs融合在酶N端进行融合酶异源表达，发现SAPs具有提高酶表达量及稳定性的功能，其中具有特殊电荷分布的S1(AEAEAKAKAEAEAKAK)具有一定的普适性效果；清华大学Lin等(FaradayDiscuss,2013,166:233)利用与S1氨基酸组成类似的SAP(LELELKLKLELELKLK)融合在酶末端，可促进生成活性包涵体，说明氨基酸组成对SAPs融合蛋白的分泌表达及稳定性有重要影响。另一方面，SAPs与酶之间的连接肽的组成对融合酶的表达及稳定性也起到重要作用(EnzymeMicrob Tech,2016,82:105-109)。

本发明尝试以SAPs为基础构建一种多肽文库，以快速、高效、便捷的得到具有高表达、高活力及高稳定性的蛋白酶突变体。

发明内容