[发明专利]修饰水稻OsSWEET基因启动子培育广谱抗白叶枯病水稻的方法

权利要求书

1.一种修饰水稻OsSWEET基因启动子培育广谱抗白叶枯病水稻的方法，其特征在于，将核苷酸序列TACTGTACACCACCAAAAGT、ATATAAAAGCACCACAACTC和CCTCCAACCAGGTGCTAAGC同时构建于CRISPR/Cas9系统中，借助农杆菌介导的转基因体系，在水稻中定点突变OsSWEET11、OsSWEET13和OsSWEET14基因，获得OsSWEET11、OsSWEET13和OsSWEET14感病基因EBE功能同时丧失的广谱抗白叶枯病水稻；

包括以下步骤：

(1)sgRNA靶位点的选择：

选择的靶点位于OsSWEET11、OsSWEET13和OsSWEET14基因启动子反义链上含有NGG序列特征的序列，即靶位点序列SW11、SW13和SW14，其中，SW11序列如SEQ ID NO.1所示，SW13序列如SEQ ID NO.2所示，SW14序列如SEQ ID NO.3所示；

(2)构建同时含有SW11、SW13和SW14序列的表达载体Cas9-gRNA5-SW134：

根据选定的gRNA靶点序列，合成引物SW11-gRNA-F/SW11-gRNA-R、SW13-gRNA-F/SW13-gRNA-R和SW14-gRNA-F/SW14-gRNA-R，将这些引物通过两两退火方法合成双链DNA gRNA-SW11、gRNA-SW13和gRNA-SW14；将gRNA-SW11和gRNA-SW14依次经BtgZI和BsaI酶切连接后插入pENTR：gRNA4载体的U6p启动子下游，获得中间载体pgRNA4-SW1114；同时，将gRNA-SW13经BtgZI酶切后连接至pENTR：gRNA5载体的U6p启动子下游，获得中间载体pgRNA5-SW13；从pgRNA4-SW1114载体上经HindIII酶切得到含有gRNA-SW11和gRNA-SW14的DNA片段，将其连接至pgRNA5-SW13载体的HindIII酶切位点，获得中间载体pgRNA5-SW134；再通过gateway方法将pgRNA5-SW134载体上含U6p启动子、gRNA-SW11、gRNA-SW14和gRNA-SW13的片段克隆到pBY02-OsCas9-ccdB载体上，获得重组载体Cas9-gRNA5-SW134；

(3)表达载体Cas9-gRNA5-SW134转化进入根癌农杆菌EHA105：

将(2)中的重组载体Cas9-gRNA5-SW134通过热激方法转化进入农杆菌EHA105菌株中，获得含有重组表达载体Cas9-gRNA5-SW134的重组农杆菌，命名为EHA105/Cas9-gRNA5-SW134；

(4)农杆菌介导的水稻转化：

利用重组根癌农杆菌EHA105/Cas9-gRNA5-SW134侵染水稻成熟胚诱导的愈伤组织，在含潮霉素抗生素培养基上成功再生及生根的植株为具有广谱抗白叶枯病水稻；

所述SW11-gRNA-F序列如SEQ ID NO.4所示，SW11-gRNA-R序列如SEQ ID NO.5所示，SW13-gRNA-F序列如SEQ ID NO.6所示，SW13-gRNA-R序列如SEQ ID NO.7所示，SW14-gRNA-F序列如SEQ ID NO.8所示，SW14-gRNA-R序列如SEQ ID NO.9所示。

2.根据权利要求1所述的一种修饰水稻OsSWEET基因启动子培育广谱抗白叶枯病水稻的方法，其特征在于，所述水稻品种为籼稻华占。

3.根据权利要求1所述的一种修饰水稻OsSWEET基因启动子培育广谱抗白叶枯病水稻的方法，其特征在于，还包括水稻突变体筛选步骤，具体方法如下：T0代苗期水稻叶片基因组提取，利用Cas9基因检测引物Cas9-F和Cas9-R扩增Cas9部分序列；再以Cas9基因阳性植株基因组为模板，SW11p-F/SW11p-R、SW13p-F/SW13p-R和SW14p-F/SW14p-R为引物分别扩增OsSWEET11、OsSWEET13和OsSWEET14基因启动子部分片段；通过对PCR产物测序验证突变水稻株系。

4.根据权利要求3所述的一种修饰水稻OsSWEET基因启动子培育广谱抗白叶枯病水稻的方法，其特征在于，引物Cas9-F序列如SEQ ID NO.10所示，引物Cas9-R序列如SEQ IDNO.11所示，引物SW11p-F序列如SEQ ID NO.12所示，引物SW11p-R序列如SEQ ID NO.13所示，引物SW13p-F序列如SEQ ID NO.14所示，引物SW13p-R序列如SEQ ID NO.15所示，引物SW14p-F序列如SEQ ID NO.16所示，引物SW14p-R序列如SEQ ID NO.17所示。