[发明专利]修饰水稻OsSWEET基因启动子培育广谱抗白叶枯病水稻的方法

说明书

本发明涉及修饰水稻OsSWEET基因启动子培育广谱抗白叶枯病水稻的方法。将核苷酸序列TACTGTACACCACCAAAAGT、ATATAAAAGCACCACAACTC和CCTCCAACCAGGTGCTAAGC同时构建于CRISPR/Cas9系统中，借助农杆菌介导的转基因体系，在水稻华占中定点突变OsSWEET11、OsSWEET13和OsSWEET14基因，获得了OsSWEET11、OsSWEET13和OsSWEET14基因启动子同时突变的水稻材料MS134HZ，广谱抗水稻白叶枯病。MS134HZ的感病基因OsSWEET11、OsSWEET13和OsSWEET14启动子EBE同时被修饰，抗白叶枯病能力提高且更广谱。在实际应用中可通过突变的MS134HZ植株与其它水稻品种杂交，培育抗病品系。

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，尤其是涉及一种修饰水稻OsSWEET基因启动子培育广谱抗白叶枯病水稻的方法。

背景技术

由稻黄单胞菌白叶枯致病变种(Xanthomonas oryzae pv.oryzae，Xoo)引起的水稻白叶枯病，是水稻上最重要的细菌性病害之一。该病在我国各稻区均有发生，南方稻区发病较重，对水稻产量影响较大，能造成水稻减产20％-30％，严重时可达50％-60％甚至是绝收。培育和种植抗性品种是防治白叶枯病的最经济有效的手段。目前，国内外已报道了40多个抗白叶枯基因，但如何合理选用这些抗性基因及创制新的抗性基因资源依赖于对Xoo与水稻互作机理的研究。

转录因子类似效应蛋白(Transcription activator like effector，简称TALE)是Xoo中一类重要的毒性因子，其通过III型分泌系统进入水稻细胞后结合到特定感病基因(Susceptible gene,简称S基因)启动子区的EBE(Effector binding element)序列而激活S基因的表达。这类S基因已知共分为两类：第一类是SWEET家族基因，包括OsSWEET11、OsSWEET13和OsSWEET14。第二类是转录因子类，如bZIP转录因子(OsTFX1)及TFIIA转录复合体的小亚基(OsTFIIAγ1)等。水稻的OsSWEET家族基因编码糖转运蛋白，通过向水稻细胞外转运糖类物质为细菌提供营养从而利于病害的发生、发展。感病基因OsSWEET11和OsSWEET13可分别被主效毒性TALE蛋白PthXo1和PthXo2激活，另一个感病基因OsSWEET14则可被4个TALE蛋白PthXo3、AvrXa7、TalC和TalF识别。因此，突变这些感病基因启动子的EBE序列可导致TALE蛋白无法与启动子结合，降低细菌侵染时感病基因的表达水平，从而提高水稻抗病性。

CRISPR/Cas9(成簇、规律间隔短回文重复序列及相关蛋白)系统是来自原核生物的获得性免疫系统。近年来被发展为对基因组进行定点编辑的新技术，在多种领域都有广泛的研究和应用。CRISPR/Cas9系统通过指导RNA(guide RNA,gRNA)锚定基因组特定序列，Cas9蛋白对被靶向的特征序列进行切割产生双链断裂，细胞启动DNA损伤修复机制，借助非同源末端连接或同源重组方式引入突变。目前，仍无运用该技术同时突变水稻OsSWEET11、OsSWEET13和OsSWEET14感病基因的报道。

发明内容

本发明的目的是，克服现有水稻抗性资源的不足，提供一种运用CRISPR/Cas9系统同时定点修饰水稻OsSWEET11、OsSWEET13和OsSWEET14基因启动子的方法，以获得OsSWEET11、OsSWEET13和OsSWEET14感病基因EBE功能同时丧失的广谱抗白叶枯病水稻新种质。

本发明通过CRISPR/Cas9技术定点突变华占水稻感病基因OsSWEET11、OsSWEET13和OsSWEET14基因启动子，创制的广谱抗病水稻株系MS134HZ具有重要应用价值。

本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：