[发明专利]β-内酰胺酶敏感型纳米探针及其制备方法和应用

说明书

β‑内酰胺酶敏感型纳米探针及其制备方法和应用，该纳米探针是以两亲性生物素‑聚乙二醇‑内酰胺‑十八胺为载体材料制备的纳米粒和包载于该聚合物纳米粒中的报告多肽构成。通过生物素与链霉亲和素琼脂糖珠反应，将纳米探针固定在琼脂糖珠上。当存在β‑内酰胺酶时，纳米探针解体释放出多肽，然后通过液相质谱联用检测报告多肽，即可检测样品中β‑内酰胺酶的量，从而检测耐药菌。该纳米探针具有制备简单、灵敏度、准确和精密度高，且可显著放大β‑内酰胺酶的信号等优点。

技术领域

本发明属于生物与医药技术领域，具体涉及一种β-内酰胺酶敏感型纳米探针及其制备方法和应用。

背景技术

自1928年青霉素发现以来的近一百年的时间里，抗生素被广泛用于治疗各种感染性疾病，拯救了数以千万计的生命。然而，由于普遍存在的抗生素不合理使用导致耐药菌甚至“超级细菌”的产生，严重威胁着大众生命健康，特别是儿童。儿童的生理系统和器官尚未发育完全，对药物有着特殊的敏感性及反应性，在使用抗生素过程中比成年人具有更大的复杂性和风险性，这就使得儿童成为了抗生素使用中的最大受害者。如何才能避免抗生素的不合理使用，关键依靠的是快速精准检测。然而目前临床上检测耐药菌的药敏实验通常耗时1-2天，这不利于快速控制病情。另一方面，耐药菌在患者病菌菌株占比极低(约0.7％)，普通的方法通常很难检测到，因此需要对样品中细菌进行扩增，这常常会造成假阳性。因此，开发一种能快速、灵敏检测患者所感染病菌中有无耐药菌，对临床用药至关重要。此外，研究表明细菌产生耐药性的主要机制是高表达β-内酰胺酶(BLA)，因此，通过定量代谢物中BLA的量可以检测出是否含药耐药菌。基于此，申请人通过联合纳米技术、蛋白质组学方法以及质谱技术，拟开发一种无创、快速、准确定量儿童感染患者代谢产物(尿液、粪便、唾液、血液等)中耐药菌的方法：BLA响应纳米探针-蛋白质组学方法。该方法可以将样品中BLA的信号扩增几百倍，并将BLA的信号转化为报告分子的信号，从而具有高选择性和特异性。

发明内容

解决的技术问题：本发明鉴于目前临床耐药菌株检测所存在的缺陷，提供一种β-内酰胺酶敏感型纳米探针及其制备方法和应用，以达到快速、无创以及精准检测耐药菌的目的。

技术方案：一种β-内酰胺酶敏感型纳米探针的制备方法，制备步骤为：按比例，将5mg两亲性聚合物生物素-聚乙二醇-(β-内酰胺)-硬脂胺(Biotin-PEG-LA-C18)和1mg报告多肽共同溶入2mL二甲基亚砜中，然后将所得混合溶液逐滴加入到10mL水溶液中，搅拌，透析除去二甲基亚砜，过220μm膜即得到纳米探针。

上述报告多肽的序列为：AVLGVDPFR、AVVGVDPFR、AVLKGDF和GVDGFG。

优选的，上述Biotin-PEG-LA-C18重均分子量2000-3000。

优选的，上述Biotin-PEG-LA-C18和报告多肽质量比为5:1。

上述Biotin-PEG-LA-C18的制备方法为：将生物素-聚乙二醇与β-内酰胺共价结合得到生物素-聚乙二醇-(β-内酰胺)，然后在与硬脂胺共价结合得到最终两亲性聚合物。

Biotin-PEG-LA-C18的具体制备步骤为：取1.0mg重均分子量为2000Da的生物素-聚乙二醇、0.2mgβ-内酰胺、0.1mg 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和0.15mgN-羟基硫代琥珀酰亚胺共同溶入50mL甲酰胺中，30℃，500rpm搅拌反应24小时；然后将反应液转移到截留分子量：1000Da的透析袋中，用去离子水透析24小时，然后冻干得到生物素-聚乙二醇-(β-内酰胺)；称取0.5mg生物素-聚乙二醇-(β-内酰胺)、0.1mg硬脂胺、0.2mg 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和0.1mg N-羟基硫代琥珀酰亚胺共同溶入50mL二甲基亚砜中，30℃，500rpm搅拌反应24小时，然后将反应液转移到截留分子量：1000Da的透析袋中，用二甲基亚砜透析12小时，然后用去离子水透析24小时，冻干得到生物素-聚乙二醇-(β-内酰胺)-硬脂胺。