[发明专利]一种内质网应激细胞模型的建立方法

说明书

本发明提供了一种内质网应激细胞模型的建立方法，涉及细胞模型技术领域。本发明所述建立方法中，将处于生长对数期的LO2细胞给予毒胡萝卜素干预，在所述干预48h后，得内质网应激细胞模型；所述LO2细胞与毒胡萝卜素的比值为10⁶个细胞：5mL所述毒胡萝卜素；所述毒胡萝卜素的浓度为0.5μm。本发明所述建立方法通过毒胡萝卜素诱导内质网应激，行WB检测TNFR1、NF‑κB、gp130、c‑Met、cyclin D1表达情况，发现再生信号存在表达差异，正是c‑Met、cyclin D1低表达，使得LO2细胞不能进入S期，肝再生受阻。本发明所述方法可为研究肝脏疾病与肝再生奠定实验基础。

技术领域

本发明属于细胞模型技术领域，具体涉及一种内质网应激细胞模型的建立方法。

背景技术

肝脏具有重要的生理功能和很强的再生能力。当肝脏受到损伤或被部分切除后，肝脏细胞通过增殖、生长，迅速恢复其原有体积和重量，该过程称为肝再生。肝再生涉及细胞多种生理活动，包括肝细胞激活、去分化、增殖及增殖调控、再分化、组织结构和功能重建等，每个过程都受到严格的调控。体内多种细胞因子和生长因子通过不同机制进行肝再生调控。肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白介素6(IL-6)、肝细胞生长因子(HGF)通过TNF-α/TNF-αI型受体(TNFR-1)/NF-κB/STAT3、IL-6/gp130/STAT3、HGF/c-Met通路等启动肝再生，细胞开始从原来的静止的GO期进入G1，并启动DNA合成，继而进入S期，促进肝细胞增殖。在终止阶段，肿瘤坏死因子-β(TNF-β)和一些细胞因子信号通路的反馈抑制和许多抑制因子对肝脏再生的负性调控从而使细胞停止生长。当然，在肝再生过程中，cyclin D1对细胞周期的调控也至关重要，其通过结合并激活Gl时期特有的周期蛋白依赖性激酶CDK4，推动细胞周期由Gl时期进入到S时期。

在人体各组织、器官细胞中，内质网在肝细胞最为丰富，其作为一种重要的膜性网状细胞器，主要参与蛋白质、脂类和糖类的合成和代谢、调控钙离子的储存和释放。当肝脏遭受损伤时均可导致内质网稳态被破坏，使内质网内的钙离子水平骤变、错误折叠蛋白和未折叠蛋白累积，诱导内质网应激(endoplasmicreticulum stress，ERS)，继而出现未折叠蛋白反应和应激反应。内质网应激广泛存在于肝硬化、病毒型肝炎、药物性肝炎等肝脏疾病。有肝损伤，就有肝再生相伴随，而目前关于内质网应激细胞模型的建立方法比较复杂，对于肝细胞再生的研究较为浅显。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种内质网应激细胞模型的建立方法，可差异性影响细胞内再生信号表达，从而简单直接制备出内质网应激细胞模型。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种内质网应激细胞模型的建立方法，包括以下步骤：

将处于生长对数期的LO2细胞给予毒胡萝卜素干预，在所述干预48h后，得内质网应激细胞模型；所述LO2细胞与毒胡萝卜素的比值为10⁶个细胞：5mL所述毒胡萝卜素；所述毒胡萝卜素的浓度为0.5μm。

优选的，所述干预的方法，包括：(1)1mmol/L的TG母液用含10％胎牛血清培养基在室温条件下稀释至2000倍，得TG工作液；

(2)用PBS缓冲液清洗所述LO2细胞两次，吸弃PBS后与所述TG工作液混合，将与TG工作液混合后的LO2细胞孵育48h。

优选的，步骤(1)所述TG工作液的浓度为0.5μm。

优选的，得所述内质网应激细胞模型后，还包括检测GRP78和肝细胞再生信号蛋白的表达量，和检测细胞活力。

优选的，所述肝细胞再生信号蛋白包括TNFR1、NF-κB、gp130、c-Met和cyclin D1。

优选的，所述检测细胞活力的方法为MTS法。