[发明专利]新型鹅星状病毒SYBR Green染料法荧光定量PCR检测试剂盒

说明书

本发明公开了一种新型鹅星状病毒荧光定量PCR检测试剂盒。所述荧光定量PCR检测试剂盒中含有SEQ ID NO.1‑SEQ ID NO.2所示的引物对，以及标准品质粒和荧光定量PCR反应试剂。本发明的荧光定量PCR试剂盒可以对新型鹅星状病毒进行检测，该试剂盒的特异性强，只与新型鹅星状病毒特异性结合，与其他鹅源病毒都没有交叉反应；而且检测的灵敏度高，在标准品为1×10¹‑1×10⁷拷贝范围内都有极好的线性关系，可以高效检测新型鹅星状病毒病鹅组织以及无临床症状的病毒携带鹅，提高了检测效率。

技术领域

本发明涉及禽病毒检测技术领域，具体涉及一种新型鹅星状病毒SYBR Green染料法荧光定量PCR检测试剂盒。

背景技术

禽星状病毒(Avastrovirus)属于星状病毒科禽星状病毒属，是一种无囊膜，单股正链RNA病毒，能感染鸡、火鸡、鸭和鹅等多种禽类。禽星状病毒包括1、2和3型，基因组长约6.9-7.9kb，包括1个5’端非编码区(UTR)，3个开放阅读框(ORFs)，即ORF1a、ORF1b和ORF2，1个3’端非编码区(UTR)和1个Poly(A)尾。ORF1a和ORF1b编码非结构蛋白，包括丝氨酸蛋白酶、核定位信号和RNA依赖性RNA聚合酶等。ORF2编码衣壳蛋白。禽星状病毒理化性质较为稳定，可抵抗氯仿、脂溶剂、各类酚类物质、多种去垢剂和大多数醇类物质等。

新型鹅星状病毒(Novel Goose Astrovirus，NGAstV)是近年来在临床发病鹅中分离鉴定的一种新型禽星状病毒。自2017年起，在我国辽宁、山东、江苏、河南和安徽等地的雏鹅群中发生一种以内脏和关节痛风为主要症状的传染性疾病，雏鹅通常在5日龄左右开始发病，在10～15日龄为死亡高峰，至20日龄左右时，鹅群的死亡率可达20％～30％，个别养殖场鹅群死亡率可高达50％，给我国养鹅业造成了严重的经济损失。患病雏鹅精神沉郁，采食下降，卧地倦动。剖检病鹅可见其心脏、肝、脾等内脏表面有明显的粉末状白色或黄白色尿酸盐沉积，肾脏肿大呈苍白色，关节肿大，关节腔内有大量尿酸盐沉积。组织病理学分析显示患鹅肾脏病变明显，肾小管上皮细胞坏死，间质出血。该病发生后，研究人员迅速进行了病毒分离鉴定和动物回归实验，证实引起该病的病原为NGAstV。

目前，该病尚无有效疫苗和药物进行预防或治疗，及早发现、准确诊断是预防该病流行、传播的重要措施。传统的电镜检测是诊断NGAstV的重要手段，但其技术要求高，操作过程繁琐，实验周期长，不适合大量样本的检测。酶联免疫吸附试验等血清学检测方法灵敏度高，检测速度快，但是其对抗体要求高，而现今尚无NGAstV的高质量单克隆抗体。普通PCR方法操作简单，适合多量样品的检测，但是该方法只能对病毒核酸进行定性检测，不能定量，而且灵敏度较低。

实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR，qPCR)以其快速、简便、灵敏度高等一系列优点被广泛用于病原微生物核酸的定性和定量检测。qPCR主要包含荧光染料标记和TaqMan探针标记两种方法，探针标记法技术要求高、成本昂贵，不利于大规模临床样品的检测。SYBR Green染料法无需专门设计探针，成本低廉，实验设计、操作简便，能够用于临床样品的高通量检测，但目前还未有关于采用SYBR Green染料法对该新型鹅星状病毒进行检测的报道。

发明内容

针对上述现有技术，本发明的目的是提供一种新型鹅星状病毒SYBR Green染料法荧光定量PCR检测试剂盒。本发明的荧光定量PCR检测试剂盒能够为NGAstV的定量检测提供技术支持。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明的第一方面，提供一组引物对，所述引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示；具体如下：

上游引物：NGAstV-F：5’-ATTAGTTGTCAGAGCAAAGACCATT-3’；(SEQ ID NO.1)