[发明专利]一种基于LAMP技术的堪萨斯分枝杆菌可视化检测方法

权利要求书

1.一种基于LAMP技术的堪萨斯分枝杆菌可视化检测方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

(1)构建LAMP反应体系，体系由引物混合液、反应缓冲液、Bst DNA聚合酶、去离子水和待测DNA构成；进行LAMP反应时，在60～70℃下进行延伸反应，在80～95℃下进行终止反应；

(2)利用横流生物传感条对步骤(1)LAMP反应产物进行检测，在硝酸纤维素膜上发现两条红线，即表示待测DNA来自于堪萨斯分枝杆菌；

所述反应缓冲液为脱氧核糖核酸恒温扩增试剂盒中的2×反应缓冲液；

所述引物混合液中的引物的序列由5′–3′如下：

2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述LAMP反应体系中，每25μL含有如下组分：

1.4μL所述引物混合液、12.5μL所述反应缓冲液、1.0μL Bst DNA聚合酶、1.0μL待测DNA、9.1μL去离子水。

3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，延伸反应时间为30～60min。

4.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于，所述反应缓冲液由如下成分组成：

5.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，终止反应时，温度为85℃，时间为5min，或者，温度为95℃，时间为2min。

6.根据权利要求1～4任一项所述的检测方法，其特征在于，所述延伸温度为67℃；和/或，所述延伸反应时间为40min。

7.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，在FIP引物的5’端用5-羧基荧光素标记；在LF引物的5’端用生物素标记。

8.根据权利要求1或7所述的检测方法，其特征在于，所述引物混合物中，各引物的浓度为：F3：0.1μM、B3：0.1μM、FIP：0.4μM、BIP：0.4μM、LF：0.2μM、LB：0.2μM。

9.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，进行步骤(2)时，将0.5μL步骤(1)所得扩增产物与100μL传感条缓冲液先后置于横流生物传感条的点样区中，待传感条缓冲液被吸收之后，在硝酸纤维素膜上发现两条红线，即表示待测DNA来自于堪萨斯分枝杆菌。

10.根据权利要求9所述的检测方法，其特征在于，所述传感条缓冲液为含有1％吐温-20、浓度为10mM的PBS溶液，其pH＝7.4。