[发明专利]一种基于LAMP技术的堪萨斯分枝杆菌可视化检测方法有效
申请号: | 201910700776.7 | 申请日: | 2019-07-31 |
公开(公告)号: | CN110273015B | 公开(公告)日: | 2023-10-13 |
发明(设计)人: | 张书 | 申请(专利权)人: | 四川省疾病预防控制中心 |
主分类号: | C12Q1/689 | 分类号: | C12Q1/689;C12Q1/6844;C12Q1/04 |
代理公司: | 北京远创理想知识产权代理事务所(普通合伙) 11513 | 代理人: | 张素妍 |
地址: | 610000 *** | 国省代码: | 四川;51 |
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摘要: | |||
搜索关键词: | 一种 基于 lamp 技术 堪萨斯 分枝杆菌 可视化 检测 方法 | ||
本发明通过设计LAMP反应体系的引物混合液并在LAMP反应之后利用横流生物传感条进行检测,获得了一种堪萨斯分枝杆菌可视化检测方法。本发明设计的引物混合液的引物序列为:F3:GGCAATGTCGATGACAACAG;B3:ACATCGGCCAGATCCTG;FIP:CCGAGCCGAACCAGATCGTGCTGCAGTTCGGCCTCCT;BIP:AAGGTTGGCCGCCCAGTAAACCCACCTGGGATGG;LF:GACTCCGGTGTTCGA;LB:GTGAACCCGCGATCT。本发明的检测限低,对于DNA样品的检测限仅为1fg/μL,对于唾液样品的检测限仅为50CFU/mL。
技术领域
本发明涉及生物检测领域,具体涉及一种基于LAMP技术的堪萨斯分枝杆菌可视化检测方法。
背景技术
非结核性分枝杆菌是除了结核分枝杆菌和麻风分枝杆菌之外的分枝杆菌,其分布广泛,主要存在于土壤和水中,包括快速生长菌和慢速生长菌两类。堪萨斯分枝杆菌属于慢速生长菌一类,是一种条件致病菌,主要引起人体肺部感染和肺外播散性感染。患有慢性肺病和肿瘤的患者、感染结核分枝杆菌和酗酒的人们感染堪萨斯分枝杆菌的几率较高。在中国,堪萨斯分枝杆菌是鸟胞类非结核分枝杆菌之后第二大引发疾病的慢速生长的非结核性分枝杆菌。
堪萨斯分枝杆菌与结核分枝杆菌的DNA相似。因此,在进行检测时,将两种菌进行区分,非常重要。传统的堪萨斯分枝杆菌检测方法是将细菌培养之后进行生化检测,这种方法不仅耗时且精度不高。而利用包括气相色谱、高效液相色谱和飞行时间质谱在内的色谱法对堪萨斯分枝杆菌进行检测则需要昂贵的仪器和复杂的操作步骤。相较之下,分子检测法更具优势。然而,目前的基因芯片法、反向杂交法和测序法仍然存在设备成本过高、检测时间较长的缺点。
因此,需要一种简单易行、设备成本低、检测精度高的堪萨斯分枝杆菌的检测方法。
发明内容
针对现有技术的缺点,本发明的目的在于提供一种对堪萨斯分枝杆菌进行检测的方法,该方法具有设备要求低、检测时间短、检测结果可视化的优点、检测限低和检测精度高的优点。
为了实现上述目的,本发明提供了如下方案:
一种基于LAMP技术的堪萨斯分枝杆菌可视化检测方法,其特征在于,所述方法包括如下步骤:
(1)构建LAMP反应体系,体系由引物混合液、反应缓冲液、Bst DNA聚合酶、去离子水和待测DNA构成;进行LAMP反应时,在60~70℃下进行延伸反应,在80~95℃下进行终止反应;
(2)利用横流生物传感条对步骤(1)LAMP反应产物进行检测,在硝酸纤维素膜上发现两条红线,即表示待测DNA来自于堪萨斯分枝杆菌;
所述反应缓冲液为脱氧核糖核酸恒温扩增试剂盒中的2×反应缓冲液;
所述引物混合液中的引物的序列由5′–3′如下:
F3 GGCAATGTCGATGACAACAG
B3 ACATCGGCCAGATCCTG
FIP CCGAGCCGAACCAGATCGTGCTGCAGTTCGGCCTCCT
BIP AAGGTTGGCCGCCCAGTAAACCCACCTGGGATGG
LF GACTCCGGTGTTCGA
LB GTGAACCCGCGATCT
。
所述LAMP反应体系中,每25μL含有如下组分:
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