[发明专利]一种测定骨钙素含量的试剂盒及其检测方法

权利要求书

1.一种测定骨钙素含量的试剂盒，其特征在于，包括磁微粒偶联N-MID捕获抗体，酶标记N-MID检测抗体，N-MID校准品，酶作用的化学发光底物，清洗液。

2.如权利要求1所述的一种测定骨钙素含量的试剂盒，其特征在于，所述N-MID校准品用缓冲液稀释而成，浓度为0ng/mL、0.5ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、50ng/mL、100ng/mL、500ng/mL、1000ng/mL，缓冲液是含有0.5-5.0％BSA的Tris或PBS或HEPES缓冲液。

3.如权利要求1所述的一种测定骨钙素含量的试剂盒，其特征在于，所述磁微粒偶联N-MID捕获抗体的制备方法为：将磁微粒用缓冲液清洗后分散；加入EDC和NHS，搅拌均匀后再加入N-MID捕获抗体，4°搅拌过夜；磁分离磁微粒，去除上清液，用缓冲液清洗磁微粒后分散；向重新分散后的磁微粒溶液中加入封闭液封闭；，磁分离磁微粒，去除上清液，用缓冲液清洗磁微粒后再次分散，得到磁微粒偶联N-MID捕获抗体溶液。

4.如权利要求1所述的一种测定骨钙素含量的试剂盒，其特征在于，所述酶为辣根过氧化物酶。

5.如权利要求1所述的一种测定骨钙素含量的试剂盒，其特征在于，所述酶标记N-MID检测抗体的制备方法为：取10mgHRP溶于0.2mL1.25％戊二醛中，20℃反应18h后，用0.15mol/L Nacl平衡过的Sephadex G-50凝胶柱层析，PBS缓冲液洗脱，除去游离的戊二醛，得到醛化的HRP溶液(10mg/ml)，将5mg N-MID检测抗体溶于1mL 0.15mol/L Nacl中，再与醛化的HRP溶液(10mg/mL)混合，加入0.1mL 1mol/L的碳酸盐缓冲液(ph9.6)，于4℃搅拌反应24h，反应结束后加入0.1mL 0.2mol/L赖氨酸，4℃反应4h，以封闭残留的醛基，终止反应，通过Sephadex G-200凝胶柱洗层析，PBS缓冲液洗脱，收集洗脱液，加入等量60％甘油，4℃保存，即得酶标记N-MID检测抗体。

6.如权利要求1所述的一种测定骨钙素含量的试剂盒，其特征在于，所述封闭液为含1％BSA的PBS缓冲液(10mM，pH 7.4)。

7.如权利要求1所述的一种测定骨钙素含量的试剂盒，其特征在于，所述的化学发光底物包括化学发光底物A液、化学发光底物B液，所述化学发光底物A液为含2mM H₂O₂、1g/L脱脂奶粉、0.5g/L卵白蛋白和0.1％Tween-20的Tris缓冲液(10mM，pH 7.0-9.0)，含有；化学发光底物B液为含有1g/L鲁米诺、2g/L对咪唑苯酚、2g/L磺丁基-β-环糊精、2.4g/L光稳定剂的Tris缓冲液(10mM，pH 7.0-9.0)。

8.如权利要求1所述的一种测定骨钙素含量的试剂盒，其特征在于，所述清洗液为含有0.05％Tween-20、0.2g/L Nacl的PBS缓冲溶液(10mM，pH 7.4)。

9.一种测定骨钙素含量试剂盒的检测方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)取10μL待检测样本于反应杯中，后加入140μL酶标记N-MID检测抗体，充分混匀，并于37℃温育10min，同时准备校准样本和空白样本；

(2)向反应体系中加入50μL磁微粒偶联N-MID捕获抗体，充分混匀，并于37℃温育10min，清洗分离磁珠；向磁珠中加入100μL化学发光底物A液和B液的混合溶液，反应并测定各管的光强度；

(3)根据校准品的浓度与光强度的关系绘制标准工作曲线，样本光强度在标准工作曲线上相对应的浓度值即为待测样品的测定浓度。