[发明专利]一种提高γ-氨基丁酸产量的方法

说明书

本发明公开了一种提高γ‑氨基丁酸产量的方法，属于基因工程和发酵工程领域。本发明敲除大肠杆菌基因组上ADP‑L‑甘油‑D‑甘露‑庚糖‑6‑差向异构酶RfaD基因得到重组菌WJW00后，利用WJW00进行发酵生产GABA，GABA产量达到0.6415g/L，是野生菌W3110(0.0135g/L)的47.52倍；且重组菌WJW00发酵产物中，副产物有机酸的含量均降低，如发酵24h时，丙酮酸、乙酸、乳酸的含量相对于野生菌W3110分别降低65.1％、38.9％、56.6％。本发明提供了一种新的提高GABA合成的方法，对于进一步提高GABA的合成具有十分重大的意义。

技术领域

本发明涉及一种提高γ-氨基丁酸产量的方法，属于基因工程和发酵工程领域。

背景技术

γ-氨基丁酸(γ-Aminobutyric acid，GABA)是一种游离氨基酸，在食品、药品、动物饲料等方面有良好的应用价值和前景。GABA是人体中枢神经系统中一种抑制性神经递质，对神经元的活动及相互联系具有抑制性调控作用，可舒肝解虑、宁心安神、降血压、降低血糖等，对多种疾病有较好的疗效。在饲料中添加GABA对猪、牛、鸡等的养殖都有促进作用。在植物中，GABA与植物生长发育密切相关。为了满足多种需求，GABA的生产是必要的。微生物发酵法生产GABA和化学合成法相比，具有生产过程和产品的安全性好、环境友好的优点；和植物提取相比，具有产量高不受季节和地域限制的优点；因而利用微生物生产GABA是发酵工程领域近年来的一个研究热点。

目前生产GABA主要通过微生物合成法，添加谷氨酸或谷氨酸钠发酵生产，利用此工艺生产GABA的菌株主要有乳酸菌、霉菌、酵母和大肠杆菌。其中霉菌和酵母生产GABA产量很低，多以乳酸菌和大肠杆菌尤为常见，但是乳酸菌合成GABA需要添加大量的谷氨酸和谷氨酸钠才能实现，虽然以L-Glu和谷氨酸钠前体生物合成GABA的研究已经取得了较高的产量，但以葡萄糖等糖类物质为起始底物直接生产GABA的研究，有助于GABA合成成本的进一步降低；且反应pH为4.5-5.0(采用50％硫酸调节pH)，大量使用硫酸对发酵罐的耐腐蚀性和生产操作的安全性都提出很高要求；此外，乳酸菌的分子改造工具不成熟，很难实现进一步的改造。而大肠杆菌的基因工程手段和工具成熟，分子操作成熟、背景清晰，且可以利用葡萄糖直接发酵生产GABA。基因工程改造的大肠杆菌在发酵生产多种产品中表现出优良的特性，因而以大肠杆菌出发菌株构建可直接合成GABA的研究具有可操作性和应用前景。

目前改造野生大肠杆菌合成GABA，一般以其代谢改造途径出发。但是这些方法使得GABA产量的提高仍然无法满足工业上生产的需求。因此，提供一种新的提高GABA合成的方法，对于进一步提高GABA的合成具有十分重大的意义。

发明内容

为了解决上述存在的技术问题，本发明敲除大肠杆菌基因组上rfaD基因得到重组菌WJW00后，利用WJW00进行发酵生产GABA，意外的发现rfaD基因的敲除可以显著改善大肠杆菌合成GABA的能力，GABA产量达到0.6415g/L，是野生对照菌W3110(0.0135g/L)的47.52倍。

本发明的第一个目的是提供一种高效合成γ-氨基丁酸(GABA)的方法，所述方法是敲除大肠杆菌基因组上ADP-L-甘油-D-甘露-庚糖-6-差向异构酶RfaD基因得到重组菌后，利用重组菌进行发酵生产。

在一种实施方式中，所述大肠杆菌为大肠杆菌W3110或大肠杆菌DH5α。

在一种实施方式中，所述ADP-L-甘油-D-甘露-庚糖-6-差向异构酶RfaD的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

在一种实施方式中，所述发酵生产是将所述的重组菌接种到发酵培养基中，以葡萄糖为底物，进行发酵生产。

在一种实施方式中，所述发酵具体是：将所述重组菌的种子液转接至发酵培养基，并加入卡那霉素和诱导剂异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)后进行发酵。