[发明专利]一种用于天花粉真伪鉴定的双抗夹心酶联免疫试剂盒及其使用鉴别方法

权利要求书

1.一种用于天花粉真伪鉴定的双抗夹心酶联免疫试剂盒，其特征在于，它是由TCS对照品、样品稀释液、酶标板、抗TCS的兔多克隆抗血清、抗TCS的鼠多克隆抗血清、羊抗鼠酶标二抗IgG-HRP、包被缓冲液、洗涤液、显色液和终止缓冲液组成；

所述抗TCS的兔多克隆抗血清和抗TCS的鼠多克隆抗血清是采用下述方法制备得到的：

(a1)将TCS对照品用pH值为7.5的PBS缓冲液溶解至1.0mg/mL，作为免疫原；

(a2)使用步骤(a1)中的TCS免疫原分别免疫新西兰大耳兔和Bal b/c小鼠；所述免疫方法为背部皮下多点注射，免疫剂量为0.4-1.0mg/只，免疫周期为2周/次，免疫次数为4次；

(a3)4次免疫结束后，收集兔血清以获得抗TCS兔多克隆抗血清，收集小鼠血清以获得抗TCS鼠多克隆抗血清。

2.根据权利要求1所述的用于天花粉真伪鉴定的双抗夹心酶联免疫试剂盒，其特征在于，所述样品稀释液中Na₂HPO₄、KH₂PO₄和NaCl的浓度分别为0.02M、0.0015M和0.14M；吐温-20在样品稀释液中的体积百分含量为0.1％；明胶在样品稀释液中的质量百分含量为0.5％。

3.根据权利要求1所述的用于天花粉真伪鉴定的双抗夹心酶联免疫试剂盒，其特征在于，所述包被缓冲液中Na₂CO₃和NaHCO₃的浓度分别为0.01M和0.04M，溶液pH值为9.6。

4.根据权利要求1所述的用于天花粉真伪鉴定的双抗夹心酶联免疫试剂盒，其特征在于，所述洗涤液中Na₂HPO₄、KH₂PO₄、NaCl在洗涤液中的浓度分别为0.02M、0.0015M、0.14M，吐温-20在洗涤液中的体积百分含量为0.1％，pH值为7.5。

5.根据权利要求1所述的用于天花粉真伪鉴定的双抗夹心酶联免疫试剂盒，其特征在于，所述显色液的溶剂为底物缓冲液，溶质为邻苯二胺和30％过氧化氢，其在显色液中的浓度分别为2mg/mL和1:2500(v:v)；所述底物缓冲液中柠檬酸三钠和Na₂HPO₄的浓度分别为0.01M和0.03M，pH值为5.5，所述显色液需现配现用。

6.根据权利要求1所述的用于天花粉真伪鉴定的双抗夹心酶联免疫试剂盒，其特征在于，所述终止缓冲液为浓度为2M的硫酸水溶液。

7.一种采用权利要求1-6中任一项所述的用于天花粉真伪鉴定的双抗夹心酶联免疫试剂盒来鉴定天花粉真伪的方法，其特征在于，它包括以下步骤：

(b1)将待测中药样品粉碎、过4号筛后，称量粉末1g，用20mL样品稀释液在4℃条件下，磁力搅拌提取30分钟后，离心取上清液，获得待测样品提取液；

(b2)将抗TCS兔血清用包被缓冲液稀释500倍后，包被于96孔酶标板上，100μL/孔，37℃包被3小时后，洗涤液洗板3次；

(b3)以样品稀释液作为空白对照，将待测中药样品提取液及空白对照加至96孔酶标板，100μL/孔，37℃反应30分钟后，洗涤液洗板3次；

(b4)将抗TCS鼠血清用样品稀释液稀释500倍后加至96孔酶标板，100μL/孔，37℃反应30分钟后，洗涤液洗板3次；

(b5)将2μg/mL羊抗鼠酶标二抗IgG-HRP加至96孔酶标板，100μL/孔，37℃反应30分钟后，洗涤液洗板3次；

(b6)取20mg邻苯二胺溶于10mL底物稀释液中，加4μL 30％H₂O₂，将底物溶液加入酶标板中，每孔100μL，避光显色10min；

(b7)每孔加入50μL终止缓冲液，用酶标仪492nm处测定各孔的吸光值A，与空白对照孔吸光值A₀的比值，即A/A₀；若A/A₀≥2.0，则确定待测中药样品为天花粉，反之，则所述待测中药样品为非天花粉。