[发明专利]一种体外维持乳腺癌干细胞干性的三维球形体培养方法

说明书

本发明公开了一种体外维持乳腺癌干细胞干性的三维球形体培养方法。采用旋转生物反应器对人乳腺癌干细胞进行三维球形体培养，直接获得乳腺癌干细胞球体，所得细胞为ALDH1⁺/CD44⁺/CD24^‑表型，是公认的乳腺癌干细胞表型，该发明方法是可靠的乳腺癌干细胞体外培养方法。本发明操作简单，且与低粘附材料法、悬滴法、凝胶法等现有技术相比，大幅提高了干细胞成球率，延长了干性维持时间可达至少21天，可大规模扩增培养，且极大降低了试剂耗材和人力资源等方面的成本。

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种体外维持乳腺癌干细胞干性的三维球形体培养方法。

背景技术

早期乳癌(I、II，IIIA和可手术IIIC级)优先考虑手术根治辅以放疗。以激素制剂、曲妥单抗和细胞毒性化疗药为代表的辅助化疗方案用于防止术后微小转移灶的形成。IIIB级和不可手术IIIC级一般使用系统性化疗或激素疗法来降级控制原发灶再进行手术或放疗治疗。上述方法虽然在短期内有效缩小瘤块体积，但若不能彻底清除癌干细胞，药效势必无法长期维持，肿瘤就极有可能耐药并复发。因此，乳腺癌干细胞对体外药物筛选至关重要。

癌干细胞(cancer stem cell，CSC)与肿瘤生长、复发以及转移密切相关，并且耐受现今绝大部分放化疗方法。数量上，它约占癌组织细胞总数的5.0％；性质上，与正常成体干细胞相似，具有自我更新和多细胞分化的能力，特异性表达乙醛脱氢酶1(ALDH1)。

CSC借助自我复制方式，非对称性地产生克隆子代和非克隆分化子代的过程恰巧实现了肿瘤异质性。自从2003年Al-Hajj首次报道具备CD44⁺/CD24^-/low表型的乳腺癌细胞为CSC之后，学者们一致认为只有CD44⁺/CD24^-/low的CSC可形成继发(复发或转移)瘤。也有报道提出，只要20个CD44⁺/CD24^-/ALDH1⁺乳腺癌CSC即可在小鼠体内成瘤，提示这群三标记的细胞致瘤性最强。

乳腺CSC与会发生失巢凋亡的分化终末细胞不同，它们可自发聚集形成乳腺球体(mammosphere)并在体外悬浮状态下持续增殖。作为CSC自我复制相关重要信号转导通路成员之一的转化生长因子-β1，其可上调乳腺上皮细胞的乳腺球形成能力达40倍，最终实现细胞EMT。另有研究显示，完成EMT的癌细胞是以“CTC clusters”而非单个细胞为移动单位离开原发灶经体循环到达远端实现转移。癌灶是一个具有三维立体空间结构的组织。因此，CSC自发形成乳腺球体是其重要的特征之一，亦是其为了实现存活、增殖和微转移所必须经历的关键生物学阶段。