[发明专利]一种Aβ42

说明书

本发明属于生物技术和化学工程领域，具体涉及一种Aβ₄₂聚集诱导发光融合体及其构建方法与应用。所述Aβ₄₂聚集诱导发光融合体具体为EPB‑Aβ₄₂4F，是将Aβ₄₂氨基酸序列中第4位的苯丙氨酸替换为对叠氮基苯丙氨酸pAZF，获得Aβ₄₂4F突变体蛋白，再将AIE分子EPB与突变体蛋白Aβ₄₂4F进行生物正交点击化学反应，获得EPB‑Aβ₄₂4F，可应用于聚集抑制剂的筛选。

技术领域：

本发明属于生物技术和化学工程领域，特别涉及一种淀粉样β蛋白1-42(Aβ₄₂)聚集诱导发光体系及其构建，并将该体系应用于Aβ₄₂聚集抑制剂的筛选中。具体为含非天然氨基酸的Aβ₄₂突变体聚集特性的验证、聚集诱导发光探针的无痕添加及该体系应用于聚集抑制剂的筛选。

背景技术：

淀粉样蛋白在细胞和组织中的聚集和错误折叠形成有毒性的中间体和淀粉样纤维可能导致各种生物学机能障碍。这些聚集中间体和纤维推测与一些神经退行性疾病和其他病症相关，例如阿尔兹海默症(Alzheimer’s disease,AD)、帕金森综合征(Parkinson’sdisease,PD)、二型糖尿病(diabetes type II)等。大量研究已经证明毒性较大的部分为低聚物或原纤维中间体，成熟纤维可能也扮演重要角色。开发有效的淀粉样蛋白聚集抑制剂成为药物研发领域治疗这些疾病的有效手段之一。因此，灵敏且有说服力的检测淀粉样纤维或中间体方法，以及在分子水平方面对纤维形成机制详细的认识，有助于治疗方案的理性设计和预防或减缓有毒淀粉样片段带来的机体损伤。近年来，一些对淀粉样纤维的结构、形态学、淀粉样蛋白全长等方面的研究已取得突破性进展，然而淀粉样蛋白聚集及错误折叠的分子机制仍未探明。

目前Aβ₄₂聚集抑制剂筛选的方法主要包括以下三个方面：(1)体外染料实验筛选。淀粉样染料例如硫黄素T(Thioflavin T,ThT)和刚果红(Congo red,CR)在疏水性环境中较敏感，当结合到淀粉样纤维的β-折叠结构时能发荧光，因此广泛用于聚集性蛋白的研究和高通量筛选及鉴定聚集抑制剂中。然而，这些染料的应用存在很多局限性，例如，利用这些染料不能检测早期聚集体的形态，同时由于小分子药物可能与这些染料竞争性地结合至淀粉样纤维上，因此不能用于精确探索小分子药物引起的纤维形态学变化。另外，染料的性质可能受缓冲溶液中其他成分的影响，因此易产生一些假阳性等。(2)荧光蛋白标记筛选。为形象化聚集过程，一些荧光蛋白，例如绿色荧光蛋白GFP与β-淀粉样蛋白1-42形成融合蛋白获得表达，并用于筛选Aβ₄₂聚集抑制剂。然而，由于GFP的分子量较大，而Aβ₄₂只有4.5kDa，因此Aβ₄₂蛋白聚集和折叠可能很难较好地导致整个融合蛋白错误折叠，因此GFP-Aβ₄₂融合蛋白的聚集折叠过程可能并非完全为Aβ₄₂的聚集过程。另外，染料和荧光蛋白的背景荧光可能对检测结果造成较大的影响。(3)分子设计和虚拟筛选。随着近年来分子模拟技术的高速发展，分子模拟技术，如分子动力学模拟、分子对接和药效团模型等，已广泛应用于解析淀粉样蛋白聚集和错误折叠及其抑制的作用机理、计算抑制剂与淀粉样蛋白之间结合作用力类型、确定抑制剂的作用位点以及筛选和设计聚集抑制剂。然而由于Aβ₄₂聚集体的构象不稳定，尤其是一些毒性最强的寡聚体三维结构至今未解析，严重制约了分子模拟技术在Aβ₄₂聚集抑制剂开发中的应用。