[发明专利]一种VBNC细菌的复苏培养基及其制备方法与应用

说明书

本发明涉及一种VBNC细菌的复苏培养基及其制备方法与应用，所述VBNC细菌的复苏培养基包括基础培养基和藤黄微球菌菌液，其中，所述基础培养基按重量份数计包括，葡萄糖1‑5份，酵母抽提物1‑5份，蛋白胨1‑10份，磷酸氢二钾0.2‑0.5份，硫酸镁0.02‑0.1份，硫酸亚铁0.005‑0.1份，氯化钠0.02‑0.1份，麦芽糖2‑10份，蒸馏水1000份；所述藤黄微球菌菌液含有复苏促进因子；所述藤黄微球菌菌液与所述基础培养基的体积比为10‑20：100。本发明还提供了相应的制备方法和应用。该复苏培养基能够有效促进VBNC细菌的复苏，且具有制备方法简单，成本低廉的优点。

技术领域

本发明涉及微生物筛选和培养领域，具体涉及一种VBNC细菌的复苏培养基及其制备方法与应用。

背景技术

利用传统的常规培养方法从自然界中只能分离到0.01-10％的可培养微生物，绝大部分微生物都处在活的但非可培养(viable but non-culturable，VBNC)状态，这种微生物的细胞仍具有代谢活性，在一定条件的刺激诱导下，能恢复活性进行代谢繁殖，近年来，对于VBNC菌的研究逐渐受到越来越多的重视。

VBNC菌指在环境胁迫下失去在培养基上形成菌落能力但保留一定生理活性的细菌，这一定义的前提是该细菌本来具有在某种培养基上生长的能力，由此与不可培养(Non-culturable bacteria)区分开。同时，与其他失活状态(Non-growing)如饥饿、芽孢、休眠、耐受态细胞相比，VBNC状态的细菌保留了细胞的完整形态，并有呼吸、蛋白质合成、基因转录等生理过程，在适宜条件下，VBNC菌液可恢复在平板上生长的能力，这一过程称为复苏(resuscitation)。

1998年Mukamolova等在培养藤黄微球菌(Micrococcus luteus)的过程中发现了复苏促进因子(resuscitation promoting factor，Rpf)，后续研究发现，Rpf蛋白对土壤中的多种VBNC状态的细菌有复苏活化作用，其不仅对高GC的革兰氏阳性菌起效果，同时对低GC的革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌也有较好的效果。

中国专利文献CN109536431A公开了一种复合生化复苏因子组合物及其应用，所述组合物包括两种Rpf蛋白和丙酮酸钠，所述两种Rpf蛋白分别为来自藤黄微球菌的重组蛋白MLUT_RS18675和来源于哈氏噬纤维菌的重组蛋白CHU_0099。这两种生物复苏因子分别作用于革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌，同时采用化学复苏因子从增强能量供给、DNA和蛋白质合成的角度以提高环境微生物的可培养性。

尽管Rpf已被应用于VBNC细菌的复苏，并可刺激正常细菌的生长，但促进效果仍较为有限，在此基础上，本领域技术人员一直致力于开发可显著促进VBNC复苏的培养基。

发明内容

本发明的目的在于提供一种VBNC细菌的复苏培养基及其制备方法与应用。

为此，本发明的第一方面，提供了一种VBNC细菌的复苏培养基，所述培养基包括基础培养基和藤黄微球菌菌液，

其中，所述基础培养基按重量份数计包括，

葡萄糖1-5份，酵母抽提物1-5份，蛋白胨1-10份，磷酸氢二钾0.2-0.5份，硫酸镁0.02-0.1份，硫酸亚铁0.005-0.1份，氯化钠0.02-0.1份，麦芽糖2-10份，蒸馏水1000份；

所述藤黄微球菌菌液含有复苏促进因子(resuscitation promoting factor，Rpf)；

所述藤黄微球菌菌液与所述基础培养基的体积比为10-20：100，优选为15-20：100。

进一步，所述基础培养基按重量份数计包括，