[发明专利]一种AEP环化酶在大肠杆菌中的融合表达方法、AEP环化酶环化能力鉴定方法及其应用

权利要求书

1.一种AEP环化酶在大肠杆菌中的融合表达方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1：将含有蛋白酶多肽底物识别序列的AEP序列与融合标签连接，构建重组DNA序列；

S2：将重组DNA序列插入表达载体，构建重组质粒；

S3：重组质粒的转化及目标蛋白表达；

S4：分离融合标签和AEP环化酶；

AEP序列如SEQ ID NO.16所示，多肽底物识别序列为LEVLFQGP，融合标签为SUMO或MBP；

还包括AEP环化酶环化能力鉴定步骤：

步骤1：获取AEP环化酶的环化底物；所述环化底物为包含SUMO蛋白酶底物序列的串联底物；所述串联底物还包含TEV蛋白酶底物序列；在SUMO蛋白酶底物的N端加上GGGGSGGGGS，在SUMO蛋白酶底物的C端依次加上Linker1序列GSGS、TEV蛋白酶的底物序列ENLYFQ/S、Linker2序列DVGGGGSEGGGSGGPGSGGEGSAGGGSAGGGS和6*His序列HHHHHH，最后在两端加上AEP环化酶的识别序列形成一个串联底物GLP-SUMO蛋白酶底物-Linker1-TEV蛋白酶底物-Linker2-STRN/GLP-6*His，AEP环化酶的识别序列如SEQ ID NO:13所示；

步骤2：AEP环化酶与环化底物反应；

步骤3：利用蛋白酶切割步骤2中的反应产物，并根据SDS-PAGE检测的目标条带结果判断AEP环化酶的环化能力；串联底物蛋白的大小是26.4 kDa，如果AEP环化酶作用于串联底物形成环化状态，则再与TEV蛋白酶反应后即线性化，那么在SDS-PAGE上就会呈现一条带，其大小应为24.38 kDa，如果AEP环化酶作用于串联底物未形成环化状态，则与TEV蛋白酶反应后，TEV蛋白酶就会将反应后的串联底物切割成两部分，那么在SDS-PAGE上就应该有两条带，一条带大小为20.31 kDa，另一条大小为4.07 kDa，且较大的一部分蛋白质大小与环化后由于TEV蛋白酶再次线性化形成的蛋白质大小相差约4.1 kDa。

2.如权利要求1所述的AEP环化酶在大肠杆菌中的融合表达方法在制备AEP环化酶中的应用。