[发明专利]一种AEP环化酶在大肠杆菌中的融合表达方法、AEP环化酶环化能力鉴定方法及其应用

说明书

本发明属于基因工程技术领域，尤其涉及一种AEP环化酶在大肠杆菌中的融合表达方法、AEP环化酶环化能力鉴定方法及其应用。本发明通过在大肠杆菌中利用不同的融合标签进行融合表达，之后通过移除融合标签得到表达量较高的AEP环化酶，其表达量为0.36±0.05mg/mL，高于原先文献报道的1.8mg/L。本发明采用一种新的方式验证AEP环化酶的环化能力，通过构建一种串联底物，选取能够较好的在SDS‑PAGE中观察到并且具备环化的可能性的蛋白为底物，并构建包含TEV蛋白酶的底物序列的串联底物，根据蛋白酶切割后底物大小的变化或者条带数量来鉴定是否环化，操作简单、方便，实用性强。

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，尤其涉及一种AEP环化酶在大肠杆菌中的融合表达方法、AEP环化酶环化能力鉴定方法及其应用。

背景技术

天冬酰胺内切酶(AEPs)是一类可催化短肽形成环化肽的关键酶，在植物体内分布广泛，其催化形成的大环寡肽具有一个环状主链和一个典型的半胱氨酸结(六个保守的半胱氨酸残基形成三个二硫键)，该结构异常稳定，使得大环寡肽具有多种生物活性因而有作为药物设计框架的巨大应用潜力。然而，从植物组织提取天然AEP环化酶操作难度大，酶的得率低，2014年Nguyen GK研究发现来源于蝶豆的天冬酰胺内切酶butelase1可有效环化大环寡肽Kalata B1的前体，但butelase1并不能在大肠杆菌重组表达，在白花蛇舌草互补DNA文库中鉴定出三种表达的AEP同种型(OaAEP1-3)，并且对于OaAEP1的一个氨基酸进行突变(Glu371Val)得到第四种序列，命名为OaAEP1_b,以下简称为AEP。研究发现AEP环化酶可在大肠杆菌重组表达，其表达量为1.8mg/L，其表达量仍不能满足工业生产的要求。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种AEP环化酶在大肠杆菌中的融合表达方法、AEP环化酶环化能力鉴定方法及其应用。

本发明是这样实现的，一种AEP环化酶在大肠杆菌中的融合表达方法，包括以下步骤：

S1：将含有蛋白酶多肽底物识别序列的AEP序列与融合标签连接，构建重组DNA序列；

S2：将重组DNA序列插入表达载体，构建重组质粒；

S3：重组质粒的转化及目标蛋白表达；

S4：分离融合标签和AEP环化酶。

进一步，步骤S1中所述融合标签为MBP、NusA、SUMO、GFP或Ubiquitin中的任一种。

进一步，步骤S1中所述蛋白酶为HRV 3V蛋白酶。

进一步，在步骤S4后面增加AEP环化酶环化能力鉴定步骤。

进一步，所述AEP环化酶环化能力鉴定步骤包括：

步骤1：获取AEP环化酶的环化底物；

步骤2：AEP环化酶与环化底物反应；

步骤3：利用蛋白酶切割步骤2中的反应产物，并根据SDS-PAGE检测的目标条带结果判断AEP环化酶的环化能力。

进一步，步骤1中所述环化底物为包含SUMO蛋白酶底物序列的串联底物。

进一步，所述串联底物还包含TEV蛋白酶底物序列。

如权利要求1-7任一所述的AEP环化酶在大肠杆菌中的融合表达方法在制备AEP环化酶中的应用。

一种AEP环化酶环化能力鉴定方法，其特征在于：所述方法为权利要求5-7中任一所述的AEP环化酶环化能力鉴定方法。

如权利要求9所述的一种AEP环化酶环化能力鉴定方法在AEP环化酶环化能力鉴定中的应用。