[发明专利]一种金果榄雌株脱毒苗培养方法

权利要求书

1.一种金果榄雌株脱毒苗培养方法，其特征在于包括以下步骤：

1）金果榄雌株的选择：金果榄雌株选择野生状态下，采集前2-3年开花结果正常，植株健壮，无病虫害的金果榄雌株作为材料采集对象；采集时间选择在每年3-6月，植株开花前，挑选主茎或侧茎生长旺盛的茎尖作为外植体；

2）金果榄雌株茎尖表面消毒：采集来的茎尖剪取茎尖1-1.5厘米，自来水添加洗洁精清洗表面附着脏物，用自来水流水冲洗10分钟，用0.3%新洁尔灭溶液浸泡表面杀菌20分钟，纯净水流水冲洗2小时，移入事先准备好的超净工作台备用；在超净工作台内先用75%酒精浸泡外植体30秒，无菌水冲洗2次，然后置于0.1%氯化汞溶液中浸泡15-20分钟，用无菌水冲洗3-5次取出放置在无菌滤纸上吸干表面水分备用；

3）金果榄雌株茎尖剥离：在已灭好菌的超净工作台内、在解剖显微镜下剥取金果榄茎尖带1-2个叶原基的0.15-0.2mm生长点，将剥离下茎尖接种于快速生长1号培养基上培养45天获得完整金果榄雌株；

4）病毒检测与脱毒株系建立：将步骤3）获得的完整植株采用ELISA法进行病毒检测，检测合格后，将合格植株接入诱导培养基以建立脱毒金果榄雌株株系；

5）金果榄雌株脱毒苗的快速繁殖：病毒检测合格后，将步骤4）中获得的合格脱毒植株控制适宜的温度、湿度、光照进行扩繁；

将合格脱毒植株茎尖接种于愈伤组织诱导2号培养基上培养45天获得愈伤组织；

将愈伤组织切成0.5× 0.5mm小块接种于继代增殖3号培养基培养45天，形成大量原球茎；

将原球茎接种于不定芽分化4号培养基培养60天，可获得大量脱毒金果榄无根苗；

将不定芽接种于生根5号培养基培养80天，可获得已生长3-5条根的完整金果榄脱毒雌株；

6）金果榄雌株脱毒苗驯化培养：将上述5）培养的金果榄雌株脱毒瓶苗移入遮阴度75%的大棚炼 苗，先将组培瓶苗移入大棚缓苗5天，逐步开取瓶盖让组培苗适应大棚环境2天，加入清水用镊子轻轻取出瓶苗，栽植于已配置好的炼 苗培养基上，按照行距株距10cm ×10cm 定植，浇足定根水，常规化培养90天，即得金果榄雌株脱毒驯化苗；

其中：

步骤3）中快速生长1号培养基的成分为：MS+6-BA1-2mg/L+NAA0.1-0.3mg/L，蔗糖30g/L，琼脂6.5g/L，pH值5.8；

步骤5）中愈伤组织诱导2号培养基的成分为：MS+6-BA1-1.5mg/L+IBA0.3-0.5mg/L+TDZ0.1-0.25mg/L+GA₃0.5-1mg/L+PVP0.05%，蔗糖30g/L，琼脂7.5g/L，pH值4.5；

步骤5）中继代增殖3号培养基的成分为：MS+6-BA1-3mg/L+NAA0.3-0.5mg/L，蔗糖30g/L，琼脂7.5g/L，马铃薯汁100g/L，pH值4.5；

步骤5）中不定芽分化4号培养基的成分为：MS+6-BA0.5-1mg/L+TDZ3-4mg/L+NAA0.1-0.2mg/L，蔗糖30g/L，琼脂6.5g/L，马铃薯汁100g/L，pH值5.8；

步骤5）中生根5号培养基的成分为：1/2MS+6-BA0.1-0.5mg/L+NAA0.5-1mg/L，蔗糖20g/L，琼脂6.5g/L，马铃薯汁100g/L，pH值5.8。

2.根据权利要求1所述一种金果榄雌株脱毒苗培养方法，其特征在于：步骤5）中控制适宜的温度为23-25℃，湿度60-80%，光照1500-2000Lux，每天光照10-12小时。