[发明专利]基于DNA四面体的固态纳米孔单分子蛋白质检测方法

说明书

本发明公开了一种基于DNA四面体的固态纳米孔单分子蛋白质检测信号放大方法及其使用的DNA四面体。本发明所述的方法包括：制备具有三维空间结构的DNA四面体：所述DNA四面体由四片核酸瓦片杂交合成，所述核酸瓦片由第一单链核酸、第二单链核酸、第三单链核酸杂交合成；DNA四面体与待测蛋白质分子连接；采用固态纳米孔检测平台进行检测；本发明克服了单分子蛋白质在应用纳米孔传感器检测时过孔速度过快的缺陷，增加检测信号的电流变化幅值，克服检测过程中蛋白质团聚的发生，样品消耗量小，检测的灵敏度高。

技术领域

本发明属于固态纳米孔单分子检测方法及其使用的载体，具体涉及一种基于DNA四面体的固态纳米孔单分子蛋白质检测信号放大方法及DNA四面体。

背景技术

在过去的二十几年里，纳米孔传感技术由于其较高的灵敏度及其功能的多样性已经受到了越来越广泛的关注。纳米孔传感器的检测原理来源于库尔特计数器。纳米孔传感器采用电阻脉冲传感作为检测方案，通常为在生物膜或人工合成的绝缘薄膜上存在纳米尺度的孔或通道，该绝缘薄膜将电解质溶液流体池隔离成两个独立的离子池，即顺式腔(Cis)与反式腔(Trans)并保证薄膜上的纳米尺度孔为唯一的离子通道。两个Ag/AgCl 电极分别插入薄膜两侧的离子池中，当一个稳定的偏置电压施加在两侧后，一个跨膜的稳定离子电流将会产生。当向腔室加入携带电荷的分析物分子后，由于静电力作用，该分子会穿过薄膜上的纳米孔通道或与孔壁作用，此时会出现瞬时的电流阻塞现象，根据检测分析的电流阻塞幅值与易位时间，能够得到分析物分子的物理化学性质(尺寸、形状、携带电荷量等)。根据其组成材料的不同，纳米孔传感器大体上分为两大类：生物纳米孔与固态纳米孔。生物纳米孔又可以称其为跨膜通道蛋白质，通常将其组装在磷脂双分子层基底上使用。目前应用比较广泛的通道蛋白大体上包括：α-溶血素蛋白(α-HL)、耻垢分枝杆菌蛋白(MspA)、气单胞菌溶素蛋白(AeL)、噬菌体phi29蛋白(Phi29)。由于其原子级精度的结构重复性以及分子尺度的孔径尺寸，生物纳米孔通常被用作对金属离子、小分子、DNA链、小蛋白质与多肽链以及与基因测序相关的核苷酸序列识别等相关检测。

尽管生物纳米孔具有诸多优点，但是由于其孔与膜的稳定性较差，对工作条件如pH 值，温度，溶液离子浓度都有较高的要求，同时通道蛋白所插入的磷脂双分子层结构稳定差，使得生物纳米孔的应用受到了极大的限制。采用固态纳米孔对单分子蛋白质检测主要依靠对蛋白质分子的过孔易位行为的检测，但由于蛋白质分子过孔速度过快的特点，易位信号的采集及电流变化幅值很低，同时，蛋白质分子很容易发生团聚，因此，在采用常规固态纳米孔对其进行传感检测时，很难保证为单个蛋白质分子易位，使得应用固态纳米孔对蛋白质的研究面临着很大的挑战。因此，提出一种具有信号放大，增加易位事件检测率的固态纳米孔单分子传感方法很有必要，以克服当前单分子蛋白质纳米孔传感的不足。

发明内容

发明目的：本发明提供一种基于DNA四面体的固态纳米孔单分子蛋白质检测信号放大方法。本发明的另一目的是提供了用于固态纳米孔单分子蛋白质检测信号放大的载体复合物。

技术方案：本发明所述的一种基于DNA四面体的固态纳米孔单分子蛋白质检测信号放大方法，包括以下步骤：

(1)制备具有三维空间结构的DNA四面体：所述DNA四面体由四片核酸瓦片杂交合成；所述核酸瓦片由第一单链核酸、第二单链核酸及第三单链核酸杂交合成；所述第一单链核酸序列由78个碱基组成，所述第一单链核酸序列如SEQ ID NO：1，所述第二单链核酸序列由42个碱基组成，所述第二单链核酸序列如SEQ ID NO：2，所述第三单链核酸序列由31个碱基组成，所述第三单链核酸序列的5’末端修饰有一个羧基基团，所述第三单链核酸序列如SEQ ID NO：3；

(2)DNA四面体与待测蛋白质分子连接：将步骤(1)中制备的DNA四面体与 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、N-羟基琥珀酰亚胺混合，加入所述待测蛋白质分子，形成DNA四面体与蛋白质复合物；